興國紅鯉精液超低溫冷凍保存及效果分析

丁淑燕++嚴維輝++郝忱++葛家春

摘要：對興國紅鯉精液的超低溫冷凍保存技術進行了研究。以解凍后精子的壽命和運動力為參數，分別探討了不同組合的稀釋液、抗凍劑以及冷凍程序對興國紅鯉精液進行超低溫冷凍保存的保護效果。試驗結果表明，選用Ringer液為稀釋液，8% DMSO為抗凍劑，按照程序-80 ℃平衡15 min，后保存于-196 ℃液氮中，37 ℃水浴100 s解凍，精液解凍激活后鏡檢，精子活力達到（83±9.6）%，壽命在（86.25±24.7） s，接近鮮精的水平。本研究結果為保護淡水魚類的種質資源提供了理論基礎。

關鍵詞：興國紅鯉；精液；超低溫保存

中圖分類號：S965.116 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0277-02

收稿日期：2015-03-16

基金項目：江蘇省科研院所社會公益研究與服務專項（編號：BM2006703）；江蘇省水產三項工程項目（編號：K2006-3）。

作者簡介：丁淑燕（1978—），女，山東煙臺人，碩士，助理研究員，主要從事水產種質資源與遺傳育種研究。Tel：（025）86581571；E-mail：dshy7869@sina.com。

通信作者：葛家春，博士，研究員，主要從事種質資源保藏與利用。Tel：（025）86581570；E-mail：gjc09@sina.com。興國紅鯉（Cyprinus carpio var.singuonesis）別稱金獅紅鯉，隸屬鯉形目鯉科鯉屬，是江西省興國縣特有的淡水養殖品種。在漁業生產上具有較廣泛的實際應用價值。據史料記載，該魚已有1 300年的養殖歷史，具有體色全紅、個體長大、背寬肉厚、肉質鮮嫩、繁殖力強等特點，深受廣大漁業工作者歡迎。由于受到長期、密集的人工選育影響以及缺乏科學的選育指導，在形態和生長性狀等方面出現了不同程度的衰退[1]。水產生物種質資源的保護關系到水產業的可持續發展。研究興國紅鯉精液的超低溫保存，無論從良種的保存還是水產上的實際生產來講都是很有意義的。本研究通過篩選D-20、Kurokura-1、Ringer液3種稀釋液和二甲基亞砜（DMSO）、甘油（Gly）、甲醇（Meth）3種抗凍劑，并對冷凍保存的精子進行活力測定，旨在探索一套有效的興國紅鯉精子超低溫冷凍保存方法。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗所用的興國紅鯉取自江蘇洪澤水產良種場，充氣運回后于筆者所在研究所水池內暫養。

1.2試驗方法

1.2.1精液的采集根據魚體質量，分別注射催產激素HRH-A2 5 μg/kg、HCG 250 IU/kg、DOM 1.5 mg/kg、腦垂體 5 mg/kg；12 h后，擠壓腹部，若有精液流出，即可取精。方法為用干毛巾擦干其生殖孔，輕輕擠壓雄魚腹部，有精液流出，采集至干燥容器中。所采集的精液要求乳白色，無血液、糞便污染。

1.2.2精子的形態觀察取1滴精液于干凈載玻片上，通過自來水流水沖洗調節密度至適中，置于空氣中干燥后，加蘇木精染色液，后再次置于空氣中干燥，再加入曙紅染色液，空氣中干燥后重新置于顯微鏡下觀察，并進行顯微攝影。

1.2.3精液質量的測定先用細口吸管吸1滴激活液于載玻片上，對準視野后，用解剖針針尖挑取培養皿中的精液，取出后立即在載玻片上的激活液中攪勻觀察，激活液激活后測活力，大于90%用于保存。將精液稀釋10 000倍，采用血球計數板計數，統計精子密度。

1.2.4稀釋液的配制將精液經過不同稀釋液適當稀釋后，分別與含有16%DMSO、25%甘油、20%甲醇的同種稀釋液等體積混合，使其終濃度為5×108 精子/mL，每管400 μL。以不含有任何保護劑的稀釋液為對照組。每組試驗均重復3次（n=3）。

1.2.5冷凍保存方法將配好的精液稀釋液迅速按照下列程序進行冷凍保存：（1）兩步冷凍：-80 ℃平衡15 min，后投入液氮中保存；（2）多步冷凍：4 ℃平衡30 min，-20 ℃平衡15 min，-80 ℃平衡15 min，后投入液氮中保存。

1.2.6解凍方法與精子激活經過一定時間的凍存，將冷凍管從液氮罐中取出，于37 ℃水浴90 s，用SM試劑（NaCl 2.6 g/L、KCl 0.4g/L、Tris-HCl 2.4 g/L，pH值為8.0）激活，具體激活方法為每900 μL SM試劑加入6 μL解凍后的精液，立即放入顯微鏡視野下觀察精子運動力和壽命。

1.2.7精子活力的測定精子活力分別以精子壽命及精子運動力來評價，精子壽命是指精子被激活至絕大部分停止搖擺運動所需的時間。精子運動力指運動精子占全部精子的百分數。

2結果與分析

2.1興國紅鯉精子的形態觀察

在400倍光學顯微鏡下，興國紅鯉精子頭部為卵圓形，尾長而彎曲，形如蝌蚪（圖1）。

2.2興國紅鯉新鮮精子的質量鑒定

該精子是一類分化程度很高的細胞，在精巢中不活動，與其生存水環境接觸后，99%的精子被激活開始做快速直線運動，經稀釋液一定程度的稀釋，血球計數板計數，其精子濃度為3.2×1010精子/mL。

2.3興國紅鯉冷凍保存精子的活力測定

2.3.1稀釋液對精子冷凍保存的影響應用上述含有16% DMSO的3種冷凍稀釋液對興國紅鯉精子按照兩步冷凍法進行冷凍保存，其冷凍保存效果見圖2。在3種稀釋液中，Ringer液的凍后成活率最高，達（83±9.6）%；壽命最長，達 （86.25±24.7） s。Kurokura-1、D-20液的凍后成活率和壽命分別為（33±20.6）%、（75±5.8）%和（54.5±28.2） s、（56.25±13.6） s。因此興國紅鯉精子冷凍保存的最適稀釋液為Ringer液。

2.3.2保護劑對精子冷凍保存的影響用Ringer液作稀釋液，按照兩步冷凍法進行冷凍保存，比較了3種抗凍劑（DMSO、Gly、Meth）的冷凍保存效果，結果見圖3。DMSO凍存興國紅鯉精子效果最好。8%的DMSO凍后精子成活率為（83±9.6）%，壽命為（86.25±24.7） s。12.5% 甘油、10%甲醇凍后精子成活率較差，分別為（7.5±9.6）%、（33±34）%；壽命較短，分別為（10.5±14.2）s、（40±36.9）s。

2.3.3冷凍程序對精子冷凍保存的影響用Ringer液作稀釋液，8% DMSO作保護劑，比較了2種冷凍方法對興國紅鯉精子的冷凍保護效果，結果見圖4。采用兩步冷凍法保存的精子成活率為（83±9.6）%，壽命為（86.25±24.7）s，而三步冷凍法保存的精子成活率為（85±5.8）%，與兩步冷凍法無顯著差異，壽命為（68±6.7）s，與兩步冷凍法差異顯著（P<0.05）。

3討論

目前，精液超低溫冷凍保存的方法一般遵循的原則是慢

凍速融，本次試驗的結果符合該原則。關于魚類精液保存稀釋液的配制至今沒有一個統一的理論依據，而且由于試驗用魚種類的不同，稀釋液可能也有所差異。目前用于魚類精液超低溫冷凍保存的稀釋液配方多數都是借鑒家畜的精液超低溫保存配方或者憑經驗配制。一般來說弱酸性稀釋液的保存效果高于弱堿性的稀釋液。本研究采用以往文獻中較為成功的幾種稀釋液配方[2-4]，通過試驗，篩選出最適合用于興國紅鯉精液超低溫保存的冷凍稀釋液—Ringer液。

不同的冷凍保護劑被成功用于不同魚類精子的超低溫冷凍保存。DMSO常被用于大菱鲆[5-6]、海鱸魚[7]、黑石斑魚[8]、美洲黃蓋鰈[9]等精子的冷凍保存，本試驗比較了DMSO、甘油、甲醇對興國紅鯉精子的冷凍保護效果，結果顯示，DMSO比甘油、甲醇更適合興國紅鯉精子的冷凍保存。DMSO對精子有毒性但又有較好防凍效果的雙重特性，在本研究中8% DMSO既能起到良好的抗凍作用，且不會導致精子損傷。

魚類精液經過冷凍保存及解凍后的激活方式對于獲得高的精子活力具有重要意義。陳松林等研究表明，在冷凍過程中，在DMSO的作用下，魚類精子的滲透壓升高，先前用于鮮精的激活方式已經不再適合凍精。如果用水直接激活，會導致凍精內外滲透壓過大，精子吸水膨脹、活力降低、壽命縮短。而用有一定滲透壓的溶液去激活凍精，效果要好得多[10]。本研究激活凍精所用的SM試劑即能獲得較好的激活效果。

魚類精液經過超低溫冷凍后，活力都有一定降低。本次試驗用曙紅染色凍精，在顯微鏡40倍物鏡下觀察發現經過冷凍/解凍后的精子中有部分精子的形態結構發生變化，主要表現在：（1）精子的細胞膜變得疏松、膨脹甚至破裂、脫落；（2）精子尾部的鞭毛斷裂，有基部斷裂和中部斷裂2種；（3）精子鞭毛非正常纏繞、扭曲。精子在冷凍/解凍過程中發生凍存損傷是難免的[11-12]。在凍存過程中，一方面由于溫度的不斷下降，精子不耐低溫可能導致結構及功能發生變化，另一方面由于加入的抗凍劑本身對精子有毒性，以及精細胞中水分不斷滲出導致精子內外滲透壓變化也會導致精子的凍存損傷。

雖然目前在冷凍稀釋液、抗凍劑、降溫速率以及激動方法等方面還沒有統一標準，但隨著精液超低溫保存技術的不斷發展，使得精子凍存后的損傷大大減小，這項技術會更加完善。

參考文獻：

[1]曾繁振，俞小牧，童金茍. 三個鯉品種微衛星豐度與遺傳多樣性分析[J]. 水生生物學報，2013，37（5）：967-973.

[2]Linhart O，Rodina M，Cosson J. Cryopreservation of sperm in common Carp cyprinus carpio：sperm motility and hatching success of embryos[J]. Cryobiology，2000，41（3）：241-250.

[3]Pan J L，Ding S Y，Ge J C，et al. Development of cryopreservation for maintaining yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco sperm[J]. Aquaculture，2008，279（1/2/3/4）：173-176.

[4]Ding S，Ge J，Hao C，et al. Long-term cryopreservation of sperm from Mandarin fish Siniperca chuatsi[J]. Animal Reproduction Science，2009，113（1/2/3/4）：229-235.

[5]Dreanno C，Suquet M，Quemener L，et al. Cryopreservation of turbot （Scophthalmus maximus） spermatozoa[J]. Theriogenology，1997，48（4）：589-603.

[6]Chen S L，Ji X S，Yu G C，et al. Cryopreservation of sperm from turbot （Scophthalmus maximus） and application to large-scale fertilization[J]. Aquaculture，2004，236（1/4）：547-556.

[7]Fauvel C，Suquet M，Dreanno C，et al. Cryopreservation of sea bass （Dicentrarchus labrax） spermatozoa in experimental and production simulating conditions[J]. Aquatic Living Resources，1998，11（6）：387-394.

[8]Palmer P J，Blackshaw A W，Garrett R N. Successful fertility experiments with cryopreserved spermatozoa of barramundi，Lates calcarifer （Bloch），using dimethylsulfoxide and glycerol as cryoprotectants[J]. Reproduction Fertility and Development，1993，5（3）：285-293.

[9]Richardson G F，Wilson C E，Crim L W，et al. Cryopreservation of yellowtail flounder（Pleuronectes platessa）semen large straws[J]. Aquaculture，1999，174（1/2）：89-94.

[10]陳松林；劉憲亭；魯大椿. 鰱、鯉、團頭魴和草魚精液冷凍保存的研究[J]. 動物學報，1992，38（4）：413-424.

[11]張軒杰，張良平，沈曉勤. 魚類冷凍精子結構變異的電子顯微鏡研究[J]. 湖南師范大學自然科學學報，1991，14（2）：160-164.

[12]侯明佳，劉睿智. 精子凍存損傷[J]. 中國優生與遺傳雜志，2005，13（4）：5-6，12.曹昆，李杰雄，韓曉磊，等. 克氏原螯蝦選育后代生長特性的初步研究[J]. 江蘇農業科學，2016，44（2）：279-281.