紅棗貯藏期間主要病原真菌的分離、鑒定與ITS序列分析

郝莉花++董彩文+++陳春生++縱偉

摘要：為了解紅棗貯藏期間主要病原真菌的污染情況，首先對紅棗表面的真菌進行分離，然后經過形態觀察，并結合 ITS 序列擴增、測序和序列比對，對分離的相關病原菌進行鑒定。結果顯示，有8種真菌菌系在紅棗表面上出現。其中，鏈格孢菌（Alternaria spp.）和青霉（Penicillium spp.） 是主要的菌株，而鏈孢霉屬（Neurospora spp.）、紙葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）是在紅棗貯藏期間新發現的2種真菌。本研究結果為控制紅棗采后病害提供了依據。

關鍵詞：紅棗；貯藏期；病原真菌；ITS 序列分析

中圖分類號： TS207.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0304-04

收稿日期：2015-02-14

基金項目：國家質檢總局科技項目（編號：2013QK232）。

作者簡介：郝莉花（1979—），女，碩士，工程師，從事食品安全檢測工作。E-mail：zzulispx@126.com。棗屬于鼠李科棗屬植物。棗樹品種多、適應性強，其果實具有豐富的營養，受到消費者的青睞，但鮮棗在自然條件下不耐貯藏。目前，由于對貯藏期間棗中病原菌種類及侵染原因缺乏了解，不能采取有效的控制措施，導致病害現象時有發生，因真菌病害侵染而導致的腐爛率達到30%以上，引起紅棗品質變差，難以食用，造成嚴重的損失[1-4]。因此，研究引起紅棗病害的病原菌，從而控制其采后病害，具有重要的意義。近年來，已有研究從貯藏的紅棗鮮果中分離并采用形態學的方法鑒定出貯藏過程中引起腐爛病害的一些主要病原真菌[5-8]，但采用ITS序列分析紅棗表面真菌的研究還少見報道。因此，本研究對紅棗表面的真菌進行分離，通過 ITS 序列擴增、測序和序列比對，對分離的相關病原菌進行鑒定。為針對性地采取措施對致腐病原菌進行控制提供依據[9-10]。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料干紅棗產自河南省新鄭市，放在無菌樣品袋中，室溫放置1個月。Taq 酶和dNTP購于TaKaRa 公司。真菌DNA提取試劑盒購于Omega 公司。

1.1.2培養基孟加拉紅培養基（蛋白胨 5 g/L、 葡萄糖10 g/L、 磷酸二氫鉀 1 g/L、 MgSO4·7H2O 0.5 g/L、 孟加拉紅 0.033 g/L、 氯霉素 0.1 g/L、 瓊脂 20 g/L），用蒸餾水溶解以上成分，然后及時加入孟加拉紅溶液。氯霉素先用少量乙醇溶解后再加入到培養基中，121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PDA）：先稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水1 000 mL 煮沸30 min，紗布過濾后再加 2% 葡萄糖和 2%瓊脂，121 ℃滅菌15 min。

1.1.2實驗儀器PCR 儀產自德國 Eppendorf 公司，電泳儀和電泳槽產自北京六一生物科技有限公司，微量移液器產自德國Eppendorf 公司，潔凈工作臺產自江蘇蘇凈集團有限公司，立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器產自合肥華泰醫療設備有限公司，恒溫培養箱產自上海鴻都電子科技有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1干棗貯藏期間病原菌的分離、純化分別從3批樣品袋中各隨機選取20顆干棗。將每個干棗放入盛有100 mL無菌水的250 mL三角瓶中，置搖床上振蕩30 min。從每瓶混合液中取 1 mL溶液加入滅菌平皿中，倒入適量的孟加拉紅培養基混勻制成平板，每瓶混合液做3個平行平板，凝固后的平板置于28 ℃培養箱中培養，隔天進行觀察。當培養出的菌落直徑達到約1 cm 時，用接種針挑取少量菌絲接入另一個含PDA培養基的培養皿內進行培養；重復以上操作2～3次后可以得到純化的菌種，保存備用。

1.2.2病原真菌總 DNA 的提取將試驗菌株的菌絲接種到 PDA 液體培養基中，28 ℃、200 r/min 振蕩培養2 d。過濾收集菌絲體，經過洗滌和干燥倒入液氮進行研磨，將勻漿液吸到1.5 mL 滅菌離心管中，按照試劑盒的操作步驟進行基因組 DNA的提取，0.8%瓊脂糖凝膠電泳法檢測 DNA。提取的DNA定量后稀釋，作為PCR 反應的模板。

1.2.3rDNA-ITS 序列的擴增真菌ITS 區擴增通用引物為ITS-5 （5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS-4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR 反應體系為50 μL（10×緩沖液 5 μL），dNTP （2.5 mmol/L） 2 μL，引物（10 μmol/L）各 2 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，用無菌水補足至總體積50 μL。PCR 反應程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，35 個循環；72 ℃延伸10 min。反應結束后取 5 μL PCR 產物加 1 μL 6×上樣緩沖液，在2%瓊脂糖凝膠上 120 V 電泳 35 min，用凝膠成像儀進行拍照。引物合成、PCR 產物純化及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.4主要病原真菌的形態顯微鏡觀察真菌形態。

1.2.5序列比對和系統發育樹的構建將測序結果輸入NCBI 基因數據庫，進行同源序列搜索，比較未知菌株與已知菌株相應序列的同源性。同時，提取相關菌株的ITS 區基因序列，與試驗菌株序列一起用Clustal X 軟件進行排列，用MEGA 6.0 軟件按照相關參數和模型構建進化樹。

2結果與分析

2.1菌株的分離純化

干棗表面分離的病原菌樣品在PDA 培養基中28 ℃培養4 d后生成的菌落，在顏色大小和菌落形態特征上都存在差異。28 ℃培養條件下XZJ2、XZJ3、XZJ4、XZJ7、XZJ10菌株在PDA 培養基上生長較好，在5 d內大量生長，可以看到較為密集的菌絲薄層，其中XZJ3和XZJ7開始分泌色素。而XZJ9在PDA 培養基上生長緩慢，5 d內仍然沒有大量生長（圖1）。

2.2基因組DNA 的提取

采用試劑盒提取真菌基因組DNA，經瓊脂糖凝膠電泳分析（圖2）。

利用DNA 試劑盒提取的真菌基因組DNA 條帶比較清晰，能夠用于下一步的PCR。

2.3rDNA-ITS PCR 擴增

以ITS5、ITS4 為引物，經PCR 得到的產物條帶特異性好，約600 bp （圖3）。

2.4紅棗貯藏期真菌菌系

將擴增的各個分離菌株的ITS PCR產物送上海生工生物技術有限公司進行純化和測序，得到的序列與GenBank 上的已知序列進行比對（表1）。試驗結果表明，在紅棗干果表面出現的真菌菌系主要有鏈格孢菌（Alternariaspp.）、青霉（Penicillium spp.）、木霉菌（Trichoderma spp.） 鏈孢霉屬（Neurospora spp.）、毛殼屬（Chaetomium spp.）、棱孢殼屬（Thielavia spp.）。其中，鏈格孢菌（Alternaria spp.）和青霉（Penicillium spp.）是紅棗干果貯藏期的優勢菌株，平均每個

紅棗表面上檢出的菌落數分別是22、1.5個。

2.5ITS 區rDNA 同源性比對與系統發育分析

由于鏈格孢菌是主要的優勢菌株，將分離得到的菌株XZJ1 和XZJ2 的ITS 區 rDNA 基因部分序列與NCBI 基因數據庫內登錄的已知菌株（表2）的相應序列進行比對，序列通過Clustal X 軟件進行排列，然后利用MEGA 6.0 軟件以NJ 法構建系統發育樹（Bootstraps=1 000）（圖4）。從鏈格孢菌的系統發育分析結果可以看出菌株XZJ1 和XZJ2 與Alternaria sp.、Alternaria brassicae、Alternaria alternata、Alternaria tenuissima 等處于同一分枝。

3結論

通過形態學并結合rDNA ITS 序列分析，從干棗中分離出7種真菌，分別是鏈格孢菌（Alternaria spp.）、青霉（Penicillium spp.）、木霉菌（Trichoderma spp.） 鏈孢霉屬（Neurospora spp.）、毛殼屬（Chaetomium spp.）、棱孢殼屬（Thielavia spp.）、紙葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）、構巢裸孢殼（Emericella nidulans）。其中，鏈格孢菌（Alternaria spp.）和青霉（Penicillium spp.）是紅棗干果貯藏期的優勢病原菌，也是引起紅棗鮮果病害的主要病原菌。同時，通過構建鏈格孢菌的系統進化樹，發現本研究鑒定出的2個菌株XZJ1 和XZJ2 與Alternaria sp.、Alternaria brassicae、Alternaria alternata、Alternaria tenuissima 處于同一分枝，而這些鏈格孢菌菌株也在別的品種的紅棗中發現[1，5，7-8，11-13]。除已經報道的真菌以外，本研究從紅棗中還鑒定出2種新的真菌，即鏈孢霉屬（Neurospora spp.）和紙葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）， 這在以

前的紅棗貯藏期真菌研究中未見報道。關于這2種真菌的作用還需進一步研究。同時，根據已經鑒定的引起紅棗病害的真菌種類，對它們的ITS 序列進行比對、分析，從而設計特異性引物，對不同的病原菌種類進行PCR鑒定，從而建立紅棗病原菌的快速檢測方法[14-15]。

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