幾種牧草根際土壤微生物功能多樣性分析

楊煒迪++高婷++朱建寧+++王錦++王川

摘要：以寧夏中部干旱帶引進的適生牧草品種（710、708、376、859）和蒙古冰草根際微生物為研究對象，采用 Biolog-Eco方法研究了5種牧草的根際微生物群落功能的多樣性。結果表明：5種不同牧草根際土壤微生物活性存在差異；利用羧酸類、碳水化合物最多的是牧草376，利用聚合物類、酚類化合物、氨基酸類最多的是708，利用胺類最多的是蒙古冰草；5個品種主要利用碳源類型為碳水化合物、羧酸類和氨基酸類。豐富度指數與優勢度指數結果相似，為859≥蒙古冰草≥710>708>376；多樣性和均勻度指數結果一致，為蒙古冰草>859>708>376>710；主成分分析將5種品種分為3個功能類群，376和708為一類，859和蒙古冰草為同一類，710為一類；載荷矩陣表明5中牧草品種在羧酸和氨基酸利用上差異最大。

關鍵詞：Biolog-Eco；根際土壤；功能多樣性；牧草

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0360-04

收稿日期：2015-08-13

項目基金：寧夏農林科學院科技創新先導資金（編號：NKYJ-2014-11）；寧夏自然科學基金（編號：NZ1073）。

作者簡介：楊煒迪（1983—），女，河南偃師人，碩士，助理研究員，研究方向為牧草育種。E-mail：12345ywol@163.com。

通信作者：高婷，碩士，研究員，研究方向為牧草新品種選育。E-mail：ecogt9@163.com。根際是指植物根周圍數毫米的區域[1]，此區域中根分泌物為微生物提供重要的營養和能量物質并影響著根際微生物的種類和繁殖，而根際微生物的代謝作用又直接促進或抑制根的營養吸收和生長，從而影響根際土壤中的物質轉化[2]。Biolog-Eco 法是在微生物利用31種碳底物時發生氧化還原反應，通過顏色變化情況來反映微生物碳源利活性的方法[3-4]。該技術廣泛應用在評價和比較不同土壤類型[5]、相同土壤不同植物物種[6]、不同植被的根際土壤微生物群落功能多樣性[7]。本研究以4種美國引進牧草和蒙古冰草的根際微生物為研究對象，應用 Biolog-Eco方法，對不同牧草品種根際土壤微生物代謝功能多樣性進行比較研究，旨在探討不同牧草品種根際微生物代謝功能多樣性之間的差異，研究結果可為深入探討植物多樣性和土壤微生物多樣性之間的關系奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗地概況

試驗地設在寧夏吳忠市鹽池縣高沙窩的天然草場。草地類型為荒漠草原，植被稀疏且草層低矮，主要植被類型為蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng.）、糙隱子草（Cleistagenes squarrosa）、胡枝子（Lespedeza bicolor Turcz.）、老瓜頭（Cynanchum komarovii Al.）、甘草（Glycyrrhiza）、細葉駱駝篷（Peganum nigellastrum）、銀灰旋花（Convolvulus ammannii Desr.）。蓋度為17%～30%，種類組成貧乏。該區屬于典型的大陸性氣候，春季干旱多風，夏季炎熱，年均降水量260.75 mm，主要集中在7—9月，月平均溫度最高月為6月（23.5 ℃）、7月（24 ℃）和8月（20.5 ℃），土壤為風沙土，土壤有機質 1.4%～7.5%，pH值9.08～9.22。

1.2牧草品種

本試驗選取4個引進美國品種（710、708、376、859）和本地優勢品種蒙古冰草開展研究。710品種耐寒性、耐旱、耐高溫能力強；708粗蛋白質含量高、干草產量高；376青綠期長、適口性好；859株高大、鮮草產量高；蒙古冰草植株高大，生長速度快。

1.3播種

將美國引進的牧草品種，隨機排列，小區面積為25 m2，行距25 cm，對試驗地隔帶深翻后，于2011年4月28日至5月1日播種，深翻比例介于30%～80%，每品種重復3 次。取樣時引進牧草品種生長年限為4年。

1.4土壤采集

6月下旬在鹽池縣高沙窩天然草場對5種牧草品種按五點取樣法選取牧草植株，每點每品種取3～5株，重復3次。將根系區域土樣用鐵鏟挖出，抖落根系外圍土，取緊貼于根表周圍的土樣。將土樣裝入無菌紙袋，標記，立即帶回實驗室，研磨過1 mm篩后于4 ℃冰箱保存。

1.5牧草根際土壤微生物群落功能多樣性研究

Biolog-Eco分析：本研究采用有31 種碳源的生態板（規格為EcoPlate，由Biolog 公司生產，華粵企業集團有限公司提供）分析微生物群落的代謝特征。每品種土樣均勻混合后按照四分法稱取10 g，加入90 mL無菌生理鹽水稀釋，在搖床里振搖30 min，靜止沉淀3～5 min，然后進行100倍稀釋，以每孔150 μL稀釋液加入微孔板中，將制備好的菌懸液倒入無菌移液槽中，使用八孔移液器將其接種于微平板的96孔中。接種好的微平板放到鋪有6層紗布的塑料飯盒中，為防止微平板鑒定孔中的菌懸液揮發，紗布保持一定的濕度。塑料飯盒用保鮮膜包裹，保鮮膜上用注射針頭扎若干個小眼，以保證微生物的培養所需要的氧氣，將微平板避光培養。ECO生態板放到30 ℃恒溫培養。分別于24、48、72、96、120、168 h時讀數，測定波長為590 nm。

2結果與分析

2.1不同牧草品種AWCD變化及利用碳源分析

從圖 1 可知，5種牧草品種根際微生物群落利用碳源量隨培養時間的延長逐漸增加。每種牧草根際土壤的 AWCD 值在 24 h 內變化不明顯，表明該時期根際微生物活性較低，碳源利用很少；在 24 h 之后顯著增加，碳源利用明顯。在整個培養過程中，各品種根際微生物 AWCD 值存在差異，培養168 h 時，總碳源AWCD值為708>710>376>蒙古冰草>859。羧酸類AWCD值為376>710>708>859>蒙古冰草，聚合物類AWCD值為708>710>376>859>蒙古冰草，碳水化合物AWCD值為376>708>710>蒙古冰草>859，酚類AWCD值為708>376>710>859>蒙古冰草，胺類AWCD值為蒙古冰草>376>708>710>859，氨基酸類AWCD值為708>710>376>蒙古冰草>859，5種牧草主要利用碳源為碳水化合物、氨基酸和羧酸類。

2.2牧草品種根際微生物群落功能多樣性分析

本研究采用豐富度、優勢度、多樣性指數和均勻度來比較5個牧草品種的土壤根際微生物群落利用31種碳源的多樣性。豐富度指數表示被利用的碳源種類多少，優勢度指數可反映出土壤群落中最常見的物種，多樣性指數反映微生物群落物種的變化度和差異度，均勻度為群落物種豐富度與均一性的度量。由表1可知，豐富度與優勢度指數為859≥蒙古冰草≥710>708>376；多樣性指數與均勻度分析結果一致，蒙古冰草>859>708>376>710，說明859、蒙古冰草根際微生物群落中某些優勢菌生長旺盛。以上研究結果表明蒙古冰草根際微生物群落種類最多且較均勻。

2.3不同牧草品種根際微生物群落功能多樣性主成分分析

采用主成分分析比較5個品種根際微生物群落功能多樣性（表2）。總變異的100%為前4個主成分，即包含全部變異信息。總變異的48.36%、21.73%分別來自第1、第2主成分，故第1、第2主成分為變異主要來源。利用這2個主成分將微生物群落代謝功能劃分成3個功能類群（圖2），376和708土壤根際微生物群落為同一類，710品種土壤根際微生物群落為同一類，859和蒙古冰草土壤根際微生物群落為同一類，空間差異較大。

因子載荷矩陣表明（表3），因子1主要由x（30）、x（15）、x（25）起分異作用，對應的碳源為D-蘋果酸、L-絲氨酸、L-磷酸葡萄糖；因子2主要由x（19）、x（18）、x（27）起分異作用，對應的碳源為L-蘇氨酸、γ-羥丁酸、苯乙胺。5種牧草根際微生物群落在以上6種碳源利用上差異最大，主要為羧酸類和氨基酸類。

3結論與討論

本試驗通過Biolog-Eco微平板方法證實了5種不同牧草的根際土壤微生物在代謝活性、不同碳源利用、微生物多樣性指數等方面均有自身特征并存在差異，說明不同牧草品種在退化土壤生態環境的修復中提供不同作用，導致這種差異的主要因素是牧草品種、植物殘體、根系分泌物等方面[11]。畢江濤等研究表明，荒漠草原 5 種植被類型土壤微生物群落代謝活性和利用碳源種類都存在差異[12]；安韶山等對寧南山區9種典型植物根際微生物研究表明微生物活性（AWCD）、微生物多樣性指數和均勻度指數均存在明顯差異[8]。利用Biolog-Eco[9-10]、16S rRNA 分析[13]、PCR-DGGE[14]等方法開展的研究均顯示不同植被類型、同一植物不同品種或不同基因型間以及同一基因型不同發育時期的根際土壤微生物多樣性都有所不同。

本試驗結果表明，不同牧草根際土壤的AWCD在24 h內變化不大，隨培養時間增加，其利用碳源量也不斷增加，與諸多文獻結果[8，15-16]一致，708、376、710的根際土壤微生物代謝活性較強，蒙古冰草和859根際土壤微生物代謝活性較弱。各品種在各類碳源利用上存在差異，利用羧酸類、碳水化合物最多的是376，利用聚合物類、酚類化合物、氨基酸類最多的是708，利用胺類最多的是蒙古冰草，5個牧草品種主要利用碳源類型為碳水化合物、羧酸類和氨基酸類，與吳則焰等研究的武夷山各植被類型土壤微生物利用主要碳源類型[7]一致。另外，鄭華等研究表明4種森林類型土壤微生物群落比較偏好、利用率較高的3類碳源是糖類、羧酸類和氨基酸類[5]。根際微生物群落功能多樣性分析表明，5種牧草的豐富度和優勢度指數結果相似，多樣性和均勻度指數結果一致，向澤宇等研究表明，土壤微生物群落多樣性與均勻度指數也表現出相似規律[17]。蒙古冰草根際微生物群落種類最多且較均勻，原因可能是蒙古冰草與其他牧草品種生長年限不同[18-19]，且蒙古冰草為原生植被，而其他4個品種為人工種植的牧草品

種[20]；859和蒙古冰草根際微生物群落中某些優勢菌生長旺盛，利用碳源類型較其他3個品種多。

5個品種根際微生物主成分分析將5個品種土壤根際微生物群落碳代謝功能分為3類，376和708為同一類，710品種為一類，859和蒙古冰草為同一類，與各品種碳源代謝活性

和根際微生物群落功能多樣性分析結果一致。林青等研究發現新疆富蘊地震斷裂帶6種次生植物根際土壤微生物碳源利用差異主要體現在糖類、氨基酸類、羧酸類[16]。因子載荷矩陣表明，5種牧草根際微生物群落主要在羧酸和氨基酸的利用上差異最大。

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類別碳源類型因子1因子2因子3因子4x（1）β-甲基-D-葡萄糖苷0.892 5-0.115 70.236 80.365 9x（2）D-半乳糖酸γ-內酯0.004 5-0.704 1-0.172 30.688 9x（3）L-精氨酸0.167 8-0.829 30.376 70.377 1x（4）丙酮酸甲酯0.582 2-0.026 60.760 9-0.285 1x（5）D-木糖/戊醛糖0.831 3-0.550 80.014 20.072 8x（6）D-半乳糖醛酸0.393 4-0.905 9-0.121 4-0.098 9x（7）L-天門冬酰胺0.273 3-0.604 20.429 00.613 3x（8）吐溫 400.015 2-0.910 20.074 10.407 3x（9）赤蘚糖醇0.274 4-0.350 90.895 3-0.002 2x（10）2-羥基苯甲酸-0.510 50.853 3-0.102 20.028 8x（11）L-苯丙氨酸-0.090 10.688 50.258 60.671 5x（12）吐溫 80-0.099 6-0.966 40.236 9-0.004 0x（13）D-甘露醇0.515 0-0.813 20.271 1-0.000 6x（14）4-羥基苯甲酸0.931 7-0.338 60.127 70.030 4x（15）L-絲氨酸0.976 7-0.136 5-0.164 80.011 2x（16）α-環式糊精-0.131 00.232 80.896 60.353 1x（17）N-乙酰-D葡萄糖氨0.911 8-0.271 20.247 70.183 4x（18）γ-羥丁酸-0.183 40.919 4-0.290 7-0.191 4x（19）L-蘇氨酸-0.144 70.926 10.347 80.019 0x（20）肝糖0.543 90.148 30.822 40.075 9x（21）D-葡糖胺酸0.509 6-0.160 60.619 00.575 6x（22）衣康酸0.551 7-0.016 9-0.821 00.146 1x（23）甘氨酰-L-谷氨酸0.598 70.401 3-0.037 20.692 2x（24）D-纖維二糖0.826 4-0.486 40.154 80.237 5x（25）1-磷酸葡萄糖0.939 5-0.276 3-0.202 10.005 0x（26）α-丁酮酸0.257 00.477 9-0.832 6-0.110 7x（27）苯乙胺-0.284 60.912 10.137 30.261 2x（28）α-D-乳糖-0.040 4-0.123 00.040 90.990 7x（29）D，L-α-磷酸甘油0.641 5-0.139 40.009 90.754 3x（30）D-蘋果酸0.978 1-0.137 8-0.090 3-0.126 7x（31）腐胺0.828 20.252 50.487 90.110 8

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