響應面法優化產纖維素酶菌株深層液體發酵的條件

藏金萍++韓志校++姜軍坡

摘要：為提高解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）Tu-115菌株產纖維素酶的能力，以濾紙酶活力為指標，根據Box-Benhnken中心組合試驗的設計原理，設計4因素3水平試驗，建立以濾紙酶活力為響應值的二次回歸方程模型，并利用響應面法分析得到深層液體發酵的最優條件是：葡萄糖含量為4.4%，豆餅粉含量為0.7%，接種量為 3.0%，裝瓶量為67.6 mL，此時供試菌株相應的濾紙酶活力達到12.32 U/mL，菌株產纖維素酶活力提高了27.4倍。

關鍵詞：響應面；濾紙酶；纖維素酶；發酵條件；菌株

中圖分類號： TQ920.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0368-03

收稿日期：2015-02-16

基金項目：國家星火計劃（編號：2010GA105010）；石家莊市科學技術研究與發展計劃（編號：08150142A）。

作者簡介：藏金萍（1981—），男，遼寧撫順人，碩士，實驗師，主要從事分子與微生物學研究。E-mail：jpzang@163.com。

通信作者：姜軍坡，碩士，講師，主要從事農業微生物方向研究。Tel：（0312）7528273；E-mail：jjp_poe@126.com。纖維素是豐富的可再生資源和碳水化合物，可轉化為糖類，并進一步轉化成乙醇、菌體蛋白或氣體燃料。農作物秸稈的主要成份是纖維素，而我國目前農作物秸稈的年產量可達10 t，其中一半以上被焚燒或廢棄[1]。人口增加和耕地面積銳減之間的矛盾，使人畜爭糧問題日益突顯。通過纖維素酶降解、利用纖維素資源已成為目前非常規資源研究的熱點[2]，提高纖維素的轉化效率，對解決當今世界面臨的環境污染、飼料資源緊張和能源危機等具有重大的現實意義[3]。

纖維素酶是微生物分解纖維素時合成的一種胞外酶，其產量直接影響纖維素的利用率。在發酵過程中，通過一定的外部條件優化，可以提高產酶活力[4]。纖維素酶發酵條件優化常采用單因素和正交試驗設計相結合的方法，但這種方法不能考察各因素之間的交互作用，無法實現各因素達到最優[5]。響應面分析法通過合理的試驗設計，可使用最少的試驗次數盡可能精確地估計各因素，對各因素水平及其交互作用進行評價和優化，快速有效地確定多因子的最佳條件[6-8]，是一個十分有效的優化試驗方法。

解淀粉芽孢桿菌Tu-115菌株是一株胞外產纖維素酶，能有效抑制大腸桿菌，本研究組對其產纖維素酶的發酵條件已進行一些研究[9-10]，但菌株固體發酵生產機械化程度較低，缺乏在線傳感儀器，過程控制較為困難，不利于大規模生產。本試驗在前期單因素試驗的基礎上，采用Box-Benhnken組合設計，考察影響Tu-115菌株深層液體發酵產纖維素酶的關鍵因素如葡萄糖含量、豆餅粉含量、接種量、裝瓶量，旨在利用響應面法確定該菌株液態發酵產纖維素酶的最佳工藝參數，為其大規模液態發酵和應用奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗菌株Tu-115菌株，由河北農業大學生命科學院制藥工程系提供。

1.1.2培養基及試劑Mandels無機鹽營養液、DNS試劑，配制方法參考文獻[9]；芽孢桿菌種子培養基和基礎發酵培養基：蛋白胨2 g、蔗糖2 g、Mandel′s無機鹽營養液100 mL，自然pH值。

1.2試驗方法

1.2.1Tu-115菌株產纖維素酶活性的測定

1.2.1.1酶活力測定原理采用3，5-二硝基水楊酸比色法[11]（DNS法）測定纖維素酶的酶活力。

1.2.1.2標準曲線的繪制精確稱取無水葡萄糖分析純100 mg，溶于蒸餾水中，定容至100 mL，即得濃度為1 mg/mL的葡萄糖標準母液；取11支試管，分別加入不同體積的葡萄糖標準母液，用蒸餾水定容至50 mL，將母液稀釋成不同濃度；分別吸取1.0 mL，分別加入3 mL DNS，沸水浴10 min；用流水冷卻至室溫，加入6.0 mL蒸餾水，混勻，測定吸光度，以葡萄糖濃度為x軸，吸光度為y軸繪制標準曲線。

1.2.1.3Tu-115發酵液纖維素酶比活力測定取發酵液 1 mL 加入EP管中，12 000 r/min離心5 min；試管中加入 0.5 mL 上清液，加入1 mL濃度為1 mol/L NaOH溶液，搖勻以終止反應；加入75 mg濾紙和1.5 mL濃度為0.05 mol/L、pH值為4.5的乙酸鈉溶液，50 ℃反應30 min；加入3 mL DNS試劑，沸水浴10 min，冷卻，所得溶液作為空白調零。

在另1支試管中加入75 mg濾紙、1.5 mL濃度為 0.05 mol/L、pH值為4.5的乙酸鈉溶液和0.5 mL粗酶液，50 ℃ 反應30 min，加入1 mL濃度為1 mol/L NaOH溶液，搖勻以終止反應；加入3 mL DNS試劑，沸水浴10 min，冷卻，測定吸光度。每1 min催化纖維素水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.2.2Tu-115菌株種子液培養將菌種用5 mL無菌蒸餾水從1支斜面培養基上沖洗下來，接種于裝有種子培養基的250 mL三角瓶中，裝瓶量為100 mL；37 ℃ 200 r/min，搖床培養12 h，待用。

1.2.3響應面優化Tu-115菌株產纖維素酶條件采用Box-Benhnken組合設計，對影響菌株產纖維素酶的4個因素分別選取不同水平（表1），以進行響應面優化分析。

2結果與分析

2.1DNS法測定葡萄糖濃度的標準曲線

根據DNS法測定葡萄糖吸光度值，得回歸方程為y=1.393 8 x（r2=0.996 6），其線性關系良好。繪制葡萄糖標準曲線見圖1。

2.2響應面發酵試驗與數據回歸

采用Box-Benhnken組合設計，對影響菌株Tu-115產纖維素酶的4個關鍵因素進行29組試驗，計算濾紙酶活力及其平均值（表2）。采用Design Expert 8.0.6軟件，對響應面試驗數據進行多元回歸擬合，以濾紙酶活力為響應值（Y），葡萄糖含量、豆餅粉含量、接種量、裝瓶量為自變量，建立回歸方程為：Y=-47.096+15.537A+1.526B+1.529C+1.198D+0.258AB+0.297AC-5.208×10-3AD+0.364BC+1.347×10-2BD+0.0680CD-1.826A2-2.877B2-0.787C2-1.025×10-2D2（R2=0.740 2），方程擬合程度良好，試驗誤差較小。

2.3回歸方程顯著性檢驗

由表3可見，以濾紙酶為指標的產纖維素酶深層液體發表3以濾紙酶為指標的產纖維素酶深層液體發酵條件響應面模型和回歸系數顯著性檢驗

酵條件響應面模型P值為0.004 3，小于0.01，說明不同條件下差異具有極顯著性，試驗方法可行；失擬項不顯著，這表明模型選擇相對合適；A、B、A2、D2對濾紙酶活的影響顯著，其他各因素交互作用均不顯著，各試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系；由P值大小可知，各因素對結果的影響大小為：豆餅粉含量>葡萄糖含量>接種量>裝瓶量。離散系數（CV）一般表示試驗的精確度，其值越小，試驗結果的可靠性越高，本試驗CV值為0.004 3，在可接受范圍內，所得二次回歸方程可以很好地對響應值進行預測。

2.4響應面分析

利用Design Expert軟件對數據進行二次多元回歸，擬合得到二次回歸方程的響應曲面及其等高線。由圖2至圖7可見，葡萄糖含量與豆餅粉含量相互作用較弱，沿豆餅粉含量方向的等高線密度大于沿葡萄糖含量方向的等高線密度，豆餅粉含量對酶活力的影響大于葡萄糖含量（圖2）；葡萄糖的含量與接種量相互作用較強，沿葡萄糖含量方向的等高線密度大于沿接種量方向的等高線密度，葡萄糖含量對酶活力的影響大于接種量（圖3）；葡萄糖的含量與裝瓶量相互作用較強，沿葡萄糖含量方向的等高線密度大于沿裝瓶量方向的等高線密度，葡萄糖含量對酶活力的影響大于裝瓶量（圖4）；接種量與豆餅粉的含量相互作用較強，沿豆餅粉含量方向的等高線密度大于沿接種量方向等高線的密度，豆餅粉含量對酶活力的影響大于接種量（圖5）；豆餅粉含量與裝瓶量相互作用較強，沿豆餅粉方向的等高線密度大于沿裝瓶量方向的等高線密度，豆餅粉含量對酶活力的影響大于裝瓶量（圖6）；接種量與裝瓶量的相互作用較強，沿裝瓶量方向的等高線密度小于沿接種量方向的等高線密度，裝瓶量對酶活力的影響小于接種量（圖7）。

2.5Tu-115菌株產纖維素酶響應面結果的優化分析和條件驗證

試驗結果表明，回歸方程對響應面法優化Tu-115菌株產纖維素酶深層液體發酵條件試驗結果擬合良好，可用此回歸方程對該菌株產纖維素酶深層液體發酵條件進行優化分析。采用Design Expert 8.0.6軟件獲取濾紙酶活力極大值，方法為：選取Optimization→Numerical→Criteria，選定指標“濾紙酶活力”；Goal設定為maximize→Solution，從Solution尋找最大響應值為12.23 U/mL，此時葡萄糖含量為4.44%、豆餅粉含量為0.67%、接種量為2.95%、裝瓶量為67.61 mL。考慮試驗的實際情況， 確定最優條件為葡萄糖含量為4.4%、豆餅粉含量為0.7%、接種量為3.0%、裝瓶量為67.6 mL，此條件測定得該菌株相應的濾紙酶活力為（12.32±0.41）U/mL（n=6）。優化前采用基礎發酵培養基培養該菌株對應的平均酶活力為（0.45±0.02）U/mL（n=6），優化后菌株產纖維素酶活力提高了27.4倍。

3結論

本試驗采用DNS染色法，通過Box-Behnken試驗設計及響應面分析，對以Tu-115菌株產纖維素酶的深層液體發酵條件進行優化，得到由影響產纖維素酶活力發酵的各因素變量構成的二次方程，該模型回歸顯著，對試驗結果擬合良好。在此基礎上，確定Tu-115菌株產纖維素酶的深層液體發酵最優工藝條件，為該菌株的大規模發酵和應用奠定了良好基礎。采用響應面法能很好地預測產纖維素酶的深層液體發酵條件，方法簡單易行，結果可靠，具有一定的實用和推廣價值。

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