1種創新單孢子分離及霉菌生長形態觀察方法

李貴正++劉紀臣+++李新柱++武磊

摘要：以淡紫擬青霉為例，介紹了1種簡易的單孢子分離及霉菌生長形態觀察方法。單孢子分離時，通過whatman濾紙過濾獲得孢子懸液，使用玻璃點樣毛細管點樣于凹玻片凹槽中央，普通光學顯微鏡下觀察獲得單孢子；生長形態觀察時，凹槽中分離的單孢子覆蓋融化的固體培養基，經濕室培養后，單菌落用棉蘭染色后觀察，加蓋蓋玻片可用油鏡觀察。該方法能快速、準確分離到單孢子，并很容易觀察不同生長期霉菌、放線菌的自然生長狀態。

關鍵詞：單孢子分離；霉菌形態；觀察

中圖分類號： S432.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）02-0390-02

收稿日期：2015-03-11

基金項目：山東省工業提質增效升級專項基金[編號：魯財企指（2014）61號]。

作者簡介：李貴正（1976—），男，山東臨沂人，碩士，工程師，主要從事微生物發酵研究。Tel：（0539）7198660；E-mail：liguizheng@kingenta.com。真菌、放線菌的純培養經常需要獲得單孢子，單孢子分離也是植物病理研究中的一項基本技術。單孢子分離的方法很多，目前常用方法有瓊脂平板稀釋純化法、微量注射器分離法[1]、單孢直接挑取分離法[2]、連續變倍體視顯微鏡分離法[3]、實體解剖鏡單孢分離法[4]、孢子震落水洋菜平板法[5]等，但這些方法操作繁瑣，且需要一些不常見的精密儀器，如微量注射器、實體解剖鏡、連續變倍體視顯微鏡等，制約了上述方法在普通實驗室的應用。沈萍等的簡易單孢子分離法，須要點樣于培養皿內壁方格內，然后將皿蓋小心、快速翻轉，然后放于低倍鏡下觀察[6]，此方法工作量較大，且觀察不方便。傳統的霉菌、放線菌形態觀察方法有直接制片觀察法、載玻片培養觀察法、插片法、玻璃紙觀察法、瓊脂槽培養法、儀器設備自動制片法等，這些方法只能觀察到真菌、放線菌某階段的形態特征，不能觀察菌絲體的自然生長狀態，且以上方法在獲得菌絲顯微特征的同時，均不能獲得菌落層次上的形態特征[7]。本研究提出了1種簡易的單孢子分離及霉菌生長形態觀察方法，該方法操作簡便易行，能很容易觀察到菌落不同層次上的形態特征，且能隨意觀察不同生長期霉菌、放線菌的自然生長狀態，以期為實驗室單孢子分離和霉菌生長形態觀察提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）購于中國農業微生物菌種保藏中心。

1.1.2培養基馬鈴薯瓊脂培養基（原配方以無菌水進行 3 ∶1稀釋，以調整其硬度和降低營養物濃度）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，補足蒸餾水至1 L。

1.1.3主要試劑和儀器“U”形玻璃棒，whatman 濾紙（孔徑10 μm，英國），凹玻片，蓋玻片，玻璃點樣毛細管（長度100 mm；內徑0.3 mm，華西醫科大學），玻璃涂布器，直徑9 cm 漏斗，乳酸石碳酸棉蘭染色液，漩渦振蕩器，擦鏡紙（濕熱滅菌后烘干備用），20% 滅菌甘油，0.05% Tween-80 無菌水，Nikon- ECLIPSE -50i 光學拍照顯微鏡（日本）。

1.2方法

1.2.1單孢子分離方法準備工作：用75%乙醇溶液擦拭漩渦振蕩器、光學顯微鏡等，超凈工作臺內紫外殺菌30 min。擬青霉培養7 d，加5 mL無菌水于培養皿中，用涂布器刮下平板表面菌落。用孔徑10 μm的 whatman 濾紙過濾 2 次得孢子懸液。加入95 mL 0.05% Tween-80無菌水和 20個直徑5 mm的玻璃珠，放在漩渦振蕩器充分振蕩10 min[8]。孢子溶液用0.05% Tween-80無菌水梯度稀釋至濃度約為10萬～30萬個/mL（血細胞計數板每大格約1 個孢子）。將毛細管放于三角瓶中，待液面升至毛細管3/4時，拿出輕輕點樣于凹玻片的凹槽中央，然后加蓋蓋玻片。用低倍鏡觀察，只保留單孢子液滴的凹玻片，其余的用擦鏡紙擦去后重新點樣。

1.2.2單菌落獲取和生長形態觀察方法準備濕室：培養皿內鋪1張圓形濾紙，然后放置 “U”形玻璃棒，棒上面放置1塊凹玻片（凹面向上），蓋上皿蓋，外用紙包扎，121 ℃濕熱滅菌30 min，然后置于100 ℃烘箱中烘干。冷卻后每皿加入 5～7 mL 20%的滅菌甘油保濕。融化培養基：將試管中稀釋好的PDA固體培養基加熱融化后放于55 ℃水浴鍋中保溫、待用。覆蓋培養基：吸取100 μL 55 ℃的培養基，迅速滴入已分離到單孢子的凹槽中，快速轉動使其平整。培養：28 ℃恒溫培養。觀察：既定時間拿出，乳酸石碳酸棉蘭染色液染色，光學顯微鏡下拍照觀察，必要時可加蓋玻片后用油鏡觀察。

2結果與分析

單孢子分離結果見圖1。

單菌落獲取結果見圖2。

每隔一定時間從培養箱中拿出凹玻片，放于顯微鏡下拍照。圖3：萌發的分生孢子；圖4：分生孢子長出菌絲體；圖5：形成密集的菌絲體；圖6：菌落中心開始產生分生孢子；圖7：

菌落邊緣還未產生分生孢子；圖8：菌落邊緣產生大量分生孢子。

3結論和討論

單純自然形態觀察時，可省去單孢子分離的步驟，毛細管點樣后直接覆蓋培養基即可；此法對產生孢子的放線菌同樣適用；如孢子直徑較小，應使用40倍的物鏡觀察分離；梯度稀釋后，顯微鏡下如有多個孢子，可用滅菌的針或牙簽挑去多余孢子；若沒有whatman濾紙，可用4層擦鏡紙替代。

本方法的創新之處：僅用凹玻片和常規的光學顯微鏡就能很容易分離到單孢子；不須要制備專門的毛細滴管，使用市售的玻璃點樣毛細管即可；加蓋蓋玻片可有效防止液滴干燥，使操作時間延長到3 min以上；通過孔徑10 μm的whatman濾紙過濾，可得純凈的孢子懸液，幾乎無菌絲體殘留；凹玻片的凹槽加入適量培養基不會外漏，且加入的培養基較薄，便于觀察；用20%甘油保濕，效果明顯優于水瓊脂；能隨時觀察真菌、放線菌的自然生長狀態。

該單孢子分離方法不需要特殊分離儀器，一般實驗室均能采用，很易觀察到不同生長期霉菌、放線菌不同層次上的自然生長狀態，可在實驗室中推廣使用。

參考文獻：

[1]高薇薇. 介紹一種簡便的真菌單孢子分離方法[J]. 中國中藥雜志，1992，17（3）：148.

[2]柴榮耀，金敏忠. 介紹一種單孢直接挑取獲得單孢菌株的方法[J]. 植物保護，1991（5）：53.

[3]張書建，何月秋. 介紹一種簡單的真菌單孢子分離法[J]. 云南農業大學學報，2003，18（3）：315-316.

[4]孫廣宇，張天宇. 一種簡易單孢子分離技術[J]. 植物檢疫，1996，10（1）：40-41.

[5]姜開梅，范靜華，朱有勇. 玉米大斑病的分離、培養和產孢方法的研究[J]. 云南農業大學學報，2004，19（3）：272-274.

[6]沈萍，范秀榮，李廣武. 微生物學實驗[M]. 北京：人民教育出版社，1980：72-74.

[7]孫建廣，周欣，肖佳雷，等. 一種便于絲狀真菌顯微觀察的培養方法[J]. 植物生理學報，2014，50（2）：229-232.

[8]汪軍，楊臘英，毛超，等. 淡紫擬青霉E7菌株固體放大發酵產孢培養基和工藝條件研究[J]. 熱帶作物學報，2013，34（10）：2038-2045.朱靈峰，郝丹迪，耿悅，等. 硅藻土基多孔陶粒的制備及其對染料廢水的吸附降解[J]. 江蘇農業科學，2016，44（2）：392-394.