四種不同品系大花君子蘭的離體組織培養(yǎng)研究

武志文，敖　鋒，鄒凡雨，郭太君，高　翔，王　麗

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，吉林 長春 130118；

2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130024)

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四種不同品系大花君子蘭的離體組織培養(yǎng)研究

武志文1，敖鋒2，鄒凡雨2，郭太君1，高翔2，王麗2

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，吉林 長春 130118；

2.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130024)

[摘要]以四種不同品系大花君子蘭的幼子房為外植體進(jìn)行了離體組織培養(yǎng)研究.結(jié)果表明：大花君子蘭幼子房愈傷誘導(dǎo)和分化成苗的能力與品系、外植體時期、光照強(qiáng)度、低溫處理時間、植物生長調(diào)節(jié)劑種類和質(zhì)量濃度及酸水解酪素質(zhì)量濃度等有關(guān).愈傷誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+蔗糖35 g/L+酸水解酪素0.4 g/L+BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L；分化成苗的最佳培養(yǎng)基為MS+蔗糖35 g/L+NAA 0.5 mg/L+KT 3.0 mg/L；生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基.

[關(guān)鍵詞]大花君子蘭；品系；幼子房；離體培養(yǎng)

君子蘭(CliviaminiataRegel)為石蒜科君子蘭屬多年生草本植物，原產(chǎn)于南非；其株型端莊、葉姿挺拔、花姿優(yōu)美、花色艷麗，是點綴居室廳堂、饋贈的理想花卉.[1-3]目前君子蘭主要繁殖方式為種子繁殖和分株繁殖.但君子蘭為高度雜合植株，種子繁殖難以保留親本的優(yōu)良性狀；而分株繁殖速度慢、效率低，無法進(jìn)行大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn).[4-6]因此，許多國內(nèi)外科研工作者開始探索利用組織離體培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖君子蘭，但研究進(jìn)展較緩慢[7-8]，且大部分研究以單一品系為研究對象，而外植體品系的不同可能導(dǎo)致研究結(jié)果出現(xiàn)較大差異.

本研究基于Wang等[9]的幼子房研究結(jié)果，以四種不同品系大花君子蘭的幼子房為外植體進(jìn)行了離體組織培養(yǎng)研究，以優(yōu)化篩選出一套適合大花君子蘭不同品系的離體培養(yǎng)技術(shù).

1材料與方法

1.1供試材料

外植體為“和尚”“油匠”“細(xì)葉”和“水晶”4種品系的大花君子蘭幼子房，依次編號為1，2，3和4號品系.

1.2試驗方法

1.2.1外植體制備及接種培養(yǎng)方法

分別取1—4號品系的幼子房，將單個子房取下，在超凈工作臺中，用75%的酒精浸泡1 min后，再用0.1%氯化汞溶液處理8 min，無菌蒸餾水沖洗5遍，用無菌濾紙吸干多余水分.將每個幼子房平均切成4塊，接種于誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中.

1.2.2培養(yǎng)條件的優(yōu)化

取不同時期的外植體，通過不同時間的低溫處理、不同的光照強(qiáng)度處理和不同質(zhì)量濃度的酸水解酪素處理，篩選出最佳的培養(yǎng)條件.

1.2.3不同品系君子蘭愈傷誘導(dǎo)、分化出苗和生根

以4種不同品系君子蘭綠色花苞的幼子房為外植體進(jìn)行24 h 4℃的低溫處理，然后將消毒后的外植體接種于愈傷培養(yǎng)基中，每個品系接種80個外植體(20瓶×4塊)，接種后放入光照培養(yǎng)箱中，23℃，2 000 lx光照8 h，40 d繼代一次，2個月后統(tǒng)計愈傷組織的誘導(dǎo)情況.愈傷誘導(dǎo)率=形成愈傷組織的外植體數(shù)/存活外植體數(shù)×100%.待愈傷組織長到2 cm×2 cm大小時，轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基.每個品系分化40塊愈傷組織(20瓶×2塊)，23℃，2 000 lx光照10 h，40 d繼代一次.統(tǒng)計轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基4個月時的分化率及平均每塊愈傷組織的出芽率，分化率=分化的愈傷組織數(shù)/存活愈傷組織數(shù)×100%.當(dāng)再生葉片數(shù)達(dá)到兩片時即可誘導(dǎo)生根：將苗分成單株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，用2 000 lx的日光燈光照14 h/d，40 d繼代一次.統(tǒng)計兩個月時的生根情況.生根率=生根植株/接種存活苗數(shù)×100%.

愈傷培養(yǎng)基：以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的BA，NAA和2，4-D；酸水解酪素0.4 g/L，蔗糖35 g/L，瓊脂5 g/L；pH=5.8.

分化培養(yǎng)基：以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的NAA和KT；蔗糖35 g/L，瓊脂5 g/L；pH=5.8.

生根培養(yǎng)基：以1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加蔗糖35 g/L和瓊脂粉5 g/L；pH=5.8.

1.2.4離體再生植株的移栽

對誘導(dǎo)生根后的再生植株進(jìn)行練苗，移栽到經(jīng)過消毒的摻有腐葉和細(xì)沙的混合土中.移栽培養(yǎng)2個月左右，植株開始長出新根，可正常生長.

2結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.1.1不同取材時期對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

根據(jù)幼子房上部花開的不同狀態(tài)，可將幼子房分為3個時期(綠色花苞期、半開花苞期、盛開花苞期)，將消毒后的幼子房接種于愈傷培養(yǎng)基上，統(tǒng)計不同開花時期幼子房的愈傷誘導(dǎo)率(見表1).

表1　不同取材時期對愈傷組織形成的影響

結(jié)果顯示，利用綠色花苞期的幼子房為外植體愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，開花時間與愈傷誘導(dǎo)率呈負(fù)相關(guān)變化.因此，盡管大花君子蘭的花期很長，但不同時期的幼子房對愈傷組織的誘導(dǎo)發(fā)生有明顯的影響，故最好采用綠色花苞期的幼子房為外植體.

2.1.2低溫處理對愈傷誘導(dǎo)率、分化率和污染率的影響

將外植體在4℃條件下進(jìn)行低溫預(yù)處理，設(shè)置0，1，2，3，4，5 d 6個時間梯度.消毒后接種于愈傷培養(yǎng)基上，統(tǒng)計不同時間低溫處理的愈傷誘導(dǎo)率、分化率和污染率(見表2).

表2　低溫處理對君子蘭幼子房愈傷誘導(dǎo)率、分化率和污染率的影響

結(jié)果顯示，低溫處理外植體對愈傷誘導(dǎo)和污染有較大的影響.低溫處理1 d左右，愈傷誘導(dǎo)率最高且污染率較低，隨著處理天數(shù)的增加誘導(dǎo)率逐漸降低、污染率隨之升高，但低溫處理對分化率影響不大，因此，最好不要將外植體低溫處理過長時間.

2.1.3光照強(qiáng)度對愈傷形成的影響

將外植體接種到培養(yǎng)基后，分別放在500，1 000和2 000 lx強(qiáng)度的日光燈下照射培養(yǎng)，每個處理50塊.兩個月后統(tǒng)計愈傷誘導(dǎo)情況(見表3).

表3　不同光強(qiáng)對誘導(dǎo)愈傷的影響

結(jié)果顯示，在500～2 000 lx范圍內(nèi)隨著光照強(qiáng)度的增加，愈傷誘導(dǎo)率呈上升趨勢，但在1 000～2 000 lx范圍內(nèi)增加幅度有所降低.有研究顯示，君子蘭離體培養(yǎng)時喜弱光，但很少給出弱光的具體范圍，因此，以實驗結(jié)果2000 lx作為較佳的光照強(qiáng)度.

2.1.4酸水解酪素的濃度對愈傷誘導(dǎo)的影響

酸水解酪素是多種氨基酸的混合物，可以提供豐富的有機(jī)氮素營養(yǎng)，是良好的組織培養(yǎng)添加物.培養(yǎng)基上添加一定濃度的酸水解酪素可以增加愈傷誘導(dǎo)，減少褐化的出現(xiàn).[10]實驗設(shè)置了3個質(zhì)量濃度(200，400和600 mg/L)梯度和空白對照，以篩選出最適宜的質(zhì)量濃度(見圖1).

結(jié)果顯示，與空白對照相比，隨著水解絡(luò)蛋白質(zhì)量濃度的增加，愈傷誘導(dǎo)率有所增加，400 mg/L處理效果最佳，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到600 mg/L時，誘導(dǎo)率有所降低且大部分愈傷呈現(xiàn)玻璃化狀態(tài).

2.2不同品系君子蘭愈傷誘導(dǎo)、分化出苗和生根結(jié)果

將幼子房消毒后接種于愈傷培養(yǎng)基中，幾天后外植體開始膨脹并產(chǎn)生白色絨毛，2個月時產(chǎn)生黃綠色、表面致密呈顆粒狀、有光澤的愈傷組織，不同品系的愈傷組織狀態(tài)不同.轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后，愈傷組織生長迅速，表面出現(xiàn)綠色芽點，通過4個月的分化誘導(dǎo)產(chǎn)生大量叢生芽(見圖2).

a—d依次為1—4號品系接種1 d的外植體；e—h依次為1—4號品系誘導(dǎo)60 d后的愈傷組織；

2.2.1愈傷誘導(dǎo)階段

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件，以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計10種不同激素組合配比(C1—C10)，2個月后觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況(見表4).

表4　不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度對愈傷組織形成的影響

從表4可以看出，植物調(diào)節(jié)劑2，4-D對君子蘭愈傷誘導(dǎo)的形成至關(guān)重要；C3為4種品系幼子房最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，同一培養(yǎng)基不同品系之間愈傷誘導(dǎo)率差異較大.

2.2.2分化出苗階段

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)計8種不同激素組合配比(D1—D8)，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基4個月后統(tǒng)計其分化率和出芽數(shù)(見表5).

表5　不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度對分化成芽的影響

從表5可以得出，D3和D7分化率較高，但D7出苗數(shù)較D3多，因此選D7為最佳分化培養(yǎng)基.同一培養(yǎng)基不同品系之間分化率和出苗率均有明顯差異；在D7培養(yǎng)基下，2號品系平均分化率高于其他品系，達(dá)到88.3%，平均出芽數(shù)為20.5個.

2.2.3不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度對誘導(dǎo)生根的影響

誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽一部分可在分化培養(yǎng)基中就開始生根，不能在分化培養(yǎng)基上生根的再生苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基兩個月后大多數(shù)都會出根.生根培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入適當(dāng)?shù)腘AA和KT，2個月后統(tǒng)計生根率(見表6).

表6　不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度對生根的影響

結(jié)果表明，激素的加入與空白對照沒有顯著差異，而且減少碳源的供應(yīng)可以加速自身的光合作用，對試管苗沒有影響.因此，我們選用R4作為最佳生根培養(yǎng)基，其中3號品系的生根率高于其他品系達(dá)到100%.

2.3再生植株的移栽

圖3　2號品系的再生植株

君子蘭再生植株的移栽以2號品系為例.誘導(dǎo)生根3個月后，將再生植株進(jìn)行3～5 d的練苗，然后移栽到經(jīng)過消毒的摻有腐葉和細(xì)沙的混合土中，給予適應(yīng)的光照和濕度等進(jìn)行培養(yǎng).移栽培養(yǎng)2個月左右，植株開始長出新根，正常生長；再生苗移栽成活率高達(dá)95%以上，再生植株之間相似度很高(見圖3).

3討論

在君子蘭的組織培養(yǎng)中，常以成熟胚為外植體，其遺傳穩(wěn)定性較差，不能良好繼承親本的優(yōu)良性狀；選用葉片作外植體，一般需要獲得無菌植株后進(jìn)行培養(yǎng)，否則不同狀態(tài)的葉片需要的消毒時間差異較大，比較煩瑣.選用幼子房為外植體能保持親體優(yōu)良的性狀，且能直接取外界材料進(jìn)行培養(yǎng)，消毒時間差異較小.通過對4種大花君子蘭幼子房的培養(yǎng)，我們優(yōu)化了一套比較理想的培養(yǎng)體系，即愈傷誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+蔗糖35 g/L+酸水解酪素0.4 g/L+BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L；分化成苗的最佳培養(yǎng)基為MS+蔗糖35 g/L+NAA 0.5 mg/L+KT 3.0 mg/L；生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基.

不良的培養(yǎng)條件也會導(dǎo)致君子蘭離體培養(yǎng)時出現(xiàn)褐化、老化和玻璃化等現(xiàn)象，因此，篩選適宜的外植體時，取材時間和部位以及光照強(qiáng)度、低溫處理時間等外界條件對君子蘭的離體培養(yǎng)尤為重要.本實驗對影響離體培養(yǎng)的條件進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出了較佳的培養(yǎng)條件：開花1～3 d的綠苞期幼子房為較佳的取材時間和部位；對外植體進(jìn)行24 h的低溫處理；光照強(qiáng)度為2 000 lx；愈傷誘導(dǎo)期加入一定量的酸水解絡(luò)素，適宜質(zhì)量濃度為400 mg/L.本文同時也進(jìn)行了暗處理實驗，結(jié)果顯示暗處理對愈傷誘導(dǎo)和分化影響不大.

隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，影響其普遍適用性的因素也逐漸顯現(xiàn)，其中品系對組織離體培養(yǎng)的影響尤為重要.在其他很多物種中，已有大量的研究顯示由于外植體品系的不同，組織離體培養(yǎng)的條件差異較大.[11-13]Ran等[14]人曾利用不同品系的大花君子蘭進(jìn)行了體外離體培養(yǎng)，結(jié)果并不理想.本文對大花君子蘭的4個優(yōu)良品系進(jìn)行了離體培養(yǎng)的實驗研究，結(jié)果表明，在相同的培養(yǎng)情況下，不同品系對愈傷誘導(dǎo)率和分化率影響較大.一般認(rèn)為，不同品系之間存在再生率差異，可能受某種基因顯性或部分顯性控制.本實驗為君子蘭大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)及其進(jìn)一步的離體培養(yǎng)研究提供了資料.

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(責(zé)任編輯：方林)

Research on tissue culture for four strains ofCliviaminiata

WU Zhi-wen1，AO Feng2，ZOU Fan-yu2，GUO Tai-jun1，GAO Xiang2，WANG Li2

(1.College of Horticulture，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China)

Abstract:A tissue culture system responsible for four strains of Clivia miniata Regel was developed using young ovaries as explants.The results showed that callus induction and differentiation rate was influenced by cultivar background，status of explant，light intensity，temperature treatment，components and concentration of plant growth regulators as well as concentration of casein hydrolysate.The best callus induction medium was MS+sucrose 35 g/L+hydrolysis casein 0.4 g/L+BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L，the optimum regeneration medium was MS+sucrose 35 g/L+NAA 0.5 mg/L+KT 3.0 mg/L，and 1/2 MS was showed to be the best rooting medium.

Keywords:Clivia miniata Regel；cultivar；young ovary；tissue culture

[中圖分類號]S 682.1+3[學(xué)科代碼]210·4060

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[作者簡介]武志文(1989—)，男，碩士研究生；通訊作者：王麗(1957—)，女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事植物花色和花香代謝的分子機(jī)制研究.

[基金項目]吉林省科技發(fā)展計劃項目(20140307021NY；20130604037TC).

[收稿日期]2015-06-12

[文章編號]1000-1832(2016)01-0115-06

[DOI]10.16163/j.cnki.22-1123/n.2016.01.024