基于ITS2和rbcL序列石斛屬植物的鑒定

王 超，郭雪玲，郭瑞軍＊

（1.內黃縣思源農業科技有限公司，河南內黃456300；2.安陽地區醫院急診科，河南安陽455000；3.西北農林科技大學生命科學學院，陜西楊凌712100）

基于ITS2和rbcL序列石斛屬植物的鑒定

王 超1，3，郭雪玲2，郭瑞軍1，3＊

（1.內黃縣思源農業科技有限公司，河南內黃456300；2.安陽地區醫院急診科，河南安陽455000；3.西北農林科技大學生命科學學院，陜西楊凌712100）

為選育優質石斛品種和開發利用高效藥用石斛資源，利用形態學分類法和DNA條形碼技術對采集到的石斛樣品進行鑒定，并對樣品ITS2序列二級結構進行分析。結果表明：樣品形態與石斛屬植物特征相似。以ITS2序列構建系統發育樹，樣品GX07與Dendrobium loddigesii，YN08與Dendrobium officinale位于同一位置，其二級結構也基本一致，螺旋區和莖環等結構均無明顯區別。基于rbcL序列構建的系統發育樹沒有達到很好的分辨效果，石斛屬種間遺傳距離最大為0.028。表明ITS2比rbcL更適合石斛屬種間物種鑒定，并且其二級結構具有一定的輔助作用。

石斛屬；ITS2；rbcL；二級結構

石斛屬（Dendrobium）是蘭科（Orchidaceae）最大的屬之一，全世界范圍內約1 500種，我國有74種和2個變種，其中多數為傳統名貴中藥［12］。鐵皮石斛和美花石斛具有益胃生津、滋陰清熱的功效，由于鐵皮石斛具有廣泛的保健作用，更是被視為石斛中的珍品［34］。石斛生長環境獨特，對溫度、濕度等自然條件要求較高，并且生長緩慢，人工種植難度大，成本高。過多依賴野生資源，使野生石斛遭到嚴重破壞，也導致醫藥市場上石斛商品來源混亂。準確鑒定對石斛品種選育及確保石斛藥效具有重要意義，然而石斛屬植物的形態特征有較大的相似性，給該屬植物的鑒定工作帶來極大困難。

DNA條形碼（DNA barcoding）技術是一種利用標準的短的DNA片段來準確、快速地進行物種鑒定的新技術［5］。Chen SL等［6］通過對753屬4 800種6 600余份樣品進行序列分析發現，ITS2在種水平上的鑒定成功率高達92.7%。陳士林等［7］經過大量的工作研究，建立了以ITS2序列為主體的藥用植物DNA條形碼鑒定體系。ITS2二級結構在多種藥用植物鑒別中得到應用，并且常被用作DNA條形碼的輔助分析手段。rbcL基因是編碼葉綠體中核酮糖－1，5－二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（Rubisco）大亞基的單拷貝序列，是植物分類中普遍應用的基因之一。為進一步選育優質石斛品種和開發藥用石斛資源，筆者利用傳統形態分類和DNA條形碼技術對所采集的2個石斛屬樣品進行分類，并對其ITS2二級結構進行分析，以期準確鑒定石斛樣品，通過比較各種鑒定方法的不同，為進一步優化石斛鑒定方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

石斛：采集自廣西欽州（編號：GX07）和云南保山（編號：YN08），由內黃縣思源農業科技有限公司提供。

1.2 DNA提取、PCR擴增及測序

分別稱取約150mg石斛放入預冷研缽中，加液氮充分研磨后，使用DNA提取試劑盒提取樣品總DNA。參考文獻［1］的方法設計ITS序列擴增引物，正向為5′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAA GG－3′，反向為5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′，擴增程序為94℃預變性5min，94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，30個循環，最后72℃延伸10min；參考文獻［8］的方法設計rbcL序列擴增引物，正向為5′－ATGTCACCACAAACAG AGACTAAAGC－3′，反向為5′－GTAAAATCAAG TCCACCRCG－3′，擴增程序為94℃預變性5min，94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，34個循環，最后72℃延伸7min。PCR產物經純化后，送上海英駿生物科技有限公司測序。

1.3 序列分析

［9］的方法，基于隱馬爾可夫模型（Hidden Markov model）的注釋方法，去除5.8S和28S區段以獲得ITS2序列，將序列在NCBI網站上用Blast工具進行同源序列比對［10］。從GenBank下載部分同源序列，利用MEGA 6.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）軟件進行分析、處理［11］，用鄰接法（Neighbor－Joining method）構建系統發育樹，鑒定分析各樣品。

2 結果與分析

2.1 形態鑒定

2個樣品形態較為相似（圖1），莖圓柱形，粗約0.3cm，具多節。樣品GX07在莖節處長出側芽，具氣生根（圖1－A）。樣品YN08的葉呈長圓披針形，先端鈍且有鉤轉，葉鞘具紫斑（圖1－B）。根據2個樣品的形態特征，將其初步鑒定為石斛屬植物。花是被子植物重要的繁殖器官，能精確反應物種的分類學地位［12］。由于所采集樣品尚未發育到開花階段，所以很難進一步確定其分類地位。

圖1 石斛樣品的形態特征Fig.1 Morphological characteristics of Dendrobiumsamples

2.2 PCR擴增及測序

由圖2可知，樣品GX07和YN08的PCR產物經凝膠電泳分析發現為單一條帶，ITS擴增產物大小約750bp（圖2－A），rbcL片段大小在500～750bp（圖2－B），均與預期目的條帶大小相符。

圖2 石斛樣品PCR產物電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of Dendrobiumsamples PCR products electrophoresis of Dendrobiumsamples

2.3 序列分析

大部分被子植物ITS區的GC含量約為50%［13］。通過比較2個樣品的ITS2序列，GX07的ITS2序列長度為248bp，GC含量為52.42%，YN08略有不同，ITS2序列長度為246bp，GC含量為51.22%。2個樣品的ITS2長度和GC含量均與栗丹等［14］測定的石斛樣品結果相符合，且2個樣品的rbcL測序長度接近，GX07樣品中為568bp，GC含量為42.43%，YN08樣品為567bp，GC含量為42.83%。

利用2個樣品的ITS2和rbcL序列在GenBank數據庫中分別進行Blast比對，結果顯示GX07與Dendrobium loddigesii，YN08與Dendrobium officinale的相似度均≥99%。Landeweert R等［15］在研究中指出，序列相似度≥99%可認定為同一種，可以初步判定GX07為美花石斛（Dendrobium loddigesii），YN08為鐵皮石斛（Dendrobium officinale）。

2.4 系統進化樹分析

由圖3可知，GX07與Dendrobium loddigesii，YN08與Dendrobium officinale位于進化樹的同一位置，且遺傳距離均為0.000，表明樣品與同一位置的物種為同一種。然而在rbcL構建的進化樹（圖4）中，其并沒有處于同一位置，遺傳距離均為0.004，這可能與樣品rbcL序列兩端個別堿基測序準確度有關。

基于ITS2序列構建的進化樹能很好地顯示出所選樣品間的差異，并且支持率較高，所選石斛屬樣品的種間遺傳距離最大、最小值分別為0.283和0.053，而rbcL序列分析顯示最大遺傳距離、最小遺傳距離分別為0.028和0.000，其中Dendrobium aduncum和Dendrobium gratiosissimum在進化樹的同一位置，遺傳距離為0.000，由此可知ITS2有較強的鑒別能力。

圖3 基于ITS2序列的系統進化樹Fig.3 The phylogenetic tree based on ITS2sequence

圖4 基于rbcL序列的系統進化樹Fig.4 The phylogenetic tree based on rbcLsequence

圖5 ITS2序列二級結構比較Fig.5 The comparisons of ITS2secondary structures

2.5 二級結構分析

從圖5可知，GX07和YN08的二級結構均包含1個中心環（主環）和4個螺旋區（Helix），在每個螺旋結構上都有大小不等、數量不同的莖環結構（Loop）。GX07與Dendrobium loddigesii，YN08與Dendrobium officinale的二級結構相同，表明ITS2二級結構在相同物種間差別較小。比較2個樣品的二級結構，在主環大小、莖環大小和位置方面均有較大區別，表明其在不同物種間具有較強的鑒別能力。

3 結論與討論

ITS（Internal Transcribed Spacer）即內轉錄間隔區，被5.8S分為ITS1和ITS2兩部分，在進化過程中受到的選擇壓力較小，進化速率較快。其中，ITS2序列片段較短、易擴增、通用性強，常被用于種和屬水平的系統發育分析［16］。試驗以紋瓣蘭（Cymbidium aloifolium）為外類群，以包含樣品在內的20條石斛屬物種的ITS2序列構建系統發育樹，發現GX07與Dendrobium loddigesii，YN08與Dendrobium officinale遺傳距離為0.000，而種間遺傳距離最小，為Dendrobium gratiosissimum和Dendrobium officinale之間的0.053，說明ITS2序列在石斛屬種內差異小、種間差異大，與嚴華［17］和Lau DT［18］等的研究結果一致。然而Xu SL等［19］通過對石斛屬184種的1 698條序列進行分析，確定ITS＋matK為最有效的條形碼組合，而ITS2對166種664條序列的鑒定效率僅22.29%。

rbcL基因長約1 400bp，容易擴增和測序，其中，長500～600bp的片段被用作植物條形碼，由于其進化速率慢，適合用于研究屬及屬以上單位的系統進化分析［20］。Xu SL等［19］的研究結果也證實了rbcL基因在石斛屬種間的分辨效率很低。通過對rbcL基因序列進行分析發現，所選石斛屬樣品的種間遺傳距離最大，為0.028，Dendrobium aduncum和Dendrobium gratiosissimum的遺傳距離為0.000，表明rbcL基因不適合石斛屬種間水平的鑒別。然而袁佐清等［21］通過rbcL基因序列構建的系統發生關系與經典的形態分類學結果基本一致。

石斛屬植物外形特征相似，該屬植物種類鑒定是蘭科植物最困難的問題之一。隨著生物技術的發展，DNA條形碼技術能夠快速準確地分辨物種，在植物鑒定中顯示出獨特的優勢。然而DNA序列的選擇極大影響了DNA條碼的準確性，ITS2和rbcL序列能否使用還有待進一步試驗驗證。

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（責任編輯：孫小嵐）

Identification of Dendrobiumby ITS2 and rbcL Sequence

WANG Chao1，3，GUO Xueling2，GUO Ruijun1，3＊
（1.Neihuang Siyuan Agri－Tech.Co.，Ltd.，Neihuang，Henan 456300；2.Emergency Department，Anyang District Hospital，Anyang，Henan 455000；3.College of Life Sciences，Northwest A＆F University，Yangling，Shaanxi 712100，China）

To breed high－quality varieties and develop resources of Dendrobium，the collected samples were identified by morphological determination and DNA barcoding method，anDThe ITS2secondary structure was predicted and analyzed.The results showeDThe morphology of the samples was similar to that of the genus Dendrobium.The phylogenetic tree based on ITS2sequence showeDThat GX07and Dendrobium loddigesii，YN08and Dendrobium officinale were located at the same position with nearly identical ITS2secondary structures.There was no significant difference in structures including Helix and Loop.However，the maximum genetic distance between genus Dendrobiumwas 0.028，without a very good resolution effect of the phylogenetic tree based on rbcLsequence.The results indicateDThat ITS2sequence may be more effective in the identification of different species of Dendrobiumwith its secondary structure playing a supportive role.

Dendrobium；ITS2；rbcL；secondary structure

R282.5

A

1001－3601（2016）10－0410－0001－04

2016－06－14；2016－10－05修回

王 超（1990－），女，從事植物系統進化研究。E－mail：zhoumo＠nwsuaf.edu.cn

＊通訊作者：郭瑞軍。E－mail：guo＿2009＿2013＠nwsuaf.edu.cn。