降解菌Pseudomonas sp.對(duì)阿特拉津的降解條件優(yōu)化

劉丹丹，劉 暢，劉長(zhǎng)風(fēng)，李欣燕

（沈陽(yáng)化工大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110142）

降解菌Pseudomonas sp.對(duì)阿特拉津的降解條件優(yōu)化

劉丹丹，劉 暢，劉長(zhǎng)風(fēng)，李欣燕

（沈陽(yáng)化工大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110142）

為微生物降解菌在農(nóng)藥污染土壤修復(fù)工程中應(yīng)用提供參考，以從長(zhǎng)期受阿特拉津污染的農(nóng)田土壤中篩選出的一株降解菌Pseudomonas sp.為研究對(duì)象，采用單因素試驗(yàn)研究其在不同培養(yǎng)條件下對(duì)阿特拉津的降解效果，并采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化該菌的降解條件。結(jié)果表明：碳源對(duì)降解效果的影響不大；培養(yǎng)時(shí)間48h，底物濃度100mg／L，溫度25～35℃，pH 5.0～8.0，鹽度0.1%～1%時(shí)，該菌對(duì)阿特拉津的降解效果較好，降解率大于90%；該菌對(duì)阿特拉津降解的最佳組合條件為溫度30℃，pH 7.0，鹽度0.5%；且3因素對(duì)降解效果的影響依次為溫度＞pH＞鹽度。

Pseudomonas sp.；微生物降解菌；阿特拉津；農(nóng)藥殘留；環(huán)境污染；降解力

阿特拉津是世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛的除草劑之一，常被用于玉米、高粱、甘蔗、茶園、果園、紅松苗圃及林地等種植地去除一年生禾本科雜草和闊葉雜草［15］。阿特拉津?qū)偃侯惢衔铮┯煤笤诃h(huán)境中的礦化時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)57個(gè)月［6］，長(zhǎng)期施用造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，在土壤、地表水和地下水體等環(huán)境介質(zhì)中均有檢出［711］。阿特拉津在環(huán)境中的長(zhǎng)效殘留特性，嚴(yán)重危害生物安全。毒理學(xué)試驗(yàn)表明，阿特拉津能夠干擾人和動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)［1214］，同時(shí)具有潛在的致癌和致畸特性［15］。因此，先后被許多國(guó)家和組織列為優(yōu)先控制污染物或禁止使用［1618］。

為有效去除環(huán)境中阿特拉津的殘留及其危害，利用降解性微生物修復(fù)阿特拉津污染的研究越來(lái)越多。1994年，菌株P(guān)seudomonas sp.YAYA6被報(bào)道能夠完全降解阿特拉津，并能夠利用阿特拉津作為唯一碳源生長(zhǎng)［19］。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)大量與阿特拉津降解相關(guān)的微生物［2023］。利用微生物治理阿特拉津污染不僅避免了傳統(tǒng)污染治理中的二次污染，且兼具經(jīng)濟(jì)高效等優(yōu)點(diǎn)，發(fā)展前景好。為此，筆者以前期試驗(yàn)中從遼寧地區(qū)長(zhǎng)期施用阿特拉津農(nóng)田土壤中分離獲得的高效阿特拉津降解菌株P(guān)seudomonas sp.為研究對(duì)象，以阿特拉津降解率為衡量指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)研究該菌在不同培養(yǎng)條件下對(duì)阿特拉津的降解效果，并在此基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化該菌的降解條件，旨在為更好地應(yīng)用降解菌株進(jìn)行阿特拉津污染土壤的生物修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株降解菌株P(guān)seudomonas sp.，從遼寧地區(qū)長(zhǎng)期施用阿特拉津的農(nóng)田土壤中分離獲得。實(shí)驗(yàn)室馴化培養(yǎng)，該菌株48h對(duì)阿特拉津的降解率可達(dá)94%，并且能以阿特拉津作為唯一氮源生長(zhǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：K2HPO41.6g、KH2PO40.4g、MgSO40.2g、NaCl 0.1g，葡萄糖3g，阿特拉津0.1g，定容至1 000mL，121℃高壓滅菌30min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同培養(yǎng)條件降解菌株對(duì)阿特拉津的降解效果參照文獻(xiàn)［24－25］的方法進(jìn)行。1）培養(yǎng)時(shí)間。將108CFU／mL降解菌轉(zhuǎn)接至阿特拉津含量100mg／L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，30℃連續(xù)避光培養(yǎng)，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間（0～72h）該降解菌株對(duì)阿特拉津的降解率，每6h測(cè)定1次，3次重復(fù)。2）底物濃度。降解菌接種至含阿特拉津50mg／L、100mg／L、200mg／L、400mg／L、800mg／L和1 200mg／L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48h測(cè)定阿特拉津降解率，3次重復(fù)。3）培養(yǎng)溫度。考察15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃等不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株降解阿特拉津能力的影響。采用1.1.2的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，3次重復(fù)（下同）。4）pH。考察pH 3～11對(duì)阿特拉津降解效果的影響。5）鹽度。分別考察0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%和3%培養(yǎng)基鹽度對(duì)阿特拉津降解的影響。6）碳源。考察葡萄糖、果糖、檸檬酸鈉、乳糖、蔗糖和淀粉為碳源對(duì)阿特拉津降解效果的影響。試驗(yàn)調(diào)整1.1.2中培養(yǎng)基碳源，30℃培養(yǎng)48h測(cè)定阿特拉津降解率，3次重復(fù)。

1.2.2 阿特拉津降解條件優(yōu)化選擇溫度、pH和鹽度3個(gè)因素，按照L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，在100mg／L阿特拉津濃度下，以阿特拉津降解率為指標(biāo)，研究菌株降解阿特拉津的最佳組合條件。

1.2.3 阿特拉津提取及含量測(cè)定參照文獻(xiàn)［26－27］的方法提取與檢測(cè)。其中，阿特拉津的提取采用等體積CHCl3萃取法；阿特拉津含量檢測(cè)采用高效液相色譜法，檢測(cè)條件為反相C18柱（4.6mm× 250mm），流動(dòng)相為甲醇和水（V／V＝80／20），流速為1mL／min，柱溫25℃，進(jìn)樣量10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)213nm。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)DPS軟件和Microsoft Office Excel 2007軟件統(tǒng)計(jì)，并采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理?xiàng)l件下降解菌對(duì)阿特拉津的降解效果

從圖1可見(jiàn)，不同培養(yǎng)時(shí)間、底物濃度、溫度、pH、鹽度和碳源處理對(duì)降解菌株P(guān)seudomonas sp.降解阿特拉津的影響不同。

2.1.1 培養(yǎng)時(shí)間在培養(yǎng)初期阿特拉津降解率升高較快，48h時(shí)阿特拉津降解率超過(guò)90%，之后直至72h降解率變化不明顯，基本保持平穩(wěn)。因此，菌株降解阿特拉津的有效時(shí)間為48h。

2.1.2 底物濃度隨著底物濃度升高，阿特拉津的降解率呈下降趨勢(shì)。其中，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0mg／L和100mg／L時(shí)，阿特拉津的降解率均較高；當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00mg／L時(shí)，降解率降至58%；底物濃度為1 200mg／L時(shí)降解率降至10%以下。阿特拉津雖然可以為降解菌生長(zhǎng)提供氮源，但其對(duì)菌體生長(zhǎng)仍有生物毒性，超過(guò)一定濃度（＞200mg／L）將抑制菌株生長(zhǎng)，出現(xiàn)阿特拉津降解受阻，降解率下降的現(xiàn)象。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間、底物濃度、溫度、pH、鹽度和碳源處理降解菌對(duì)阿特拉津的降解效果Fig1. Degradation effect of culture time，substrate concentration，temperature，pH，salinity and carbon on Atrazine degradation of a Pseudomonas sp.strain

2.1.3 溫度隨著底物濃度升高，阿特拉津的降解率呈先上升后下降趨勢(shì)。當(dāng)溫度在25～35℃時(shí)，阿特拉津的降解效果較好，表明降解菌有較強(qiáng)的溫度適應(yīng)性。低溫和高溫對(duì)菌株降解能力均有不同程度的影響，但低溫對(duì)阿特拉津降解的影響更大，這與前人［2829］發(fā)現(xiàn)的很多降解菌株具有相似性。

2.1.4 pH隨著pH的升高，阿特拉津降解率總體呈先上升后下降的趨勢(shì)。溶液pH在6.0～9.0時(shí)，阿特拉津降解率較高，pH 7.0時(shí)降解率達(dá)最大，為96%。可見(jiàn)，降解菌具有較好的酸堿耐受性，但強(qiáng)酸和強(qiáng)堿環(huán)境仍不利于菌株降解能力的發(fā)揮。較強(qiáng)的酸堿環(huán)境對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)生較大的滲透壓力，造成細(xì)胞溶質(zhì)外滲和生長(zhǎng)發(fā)育受阻等，從而影響菌株對(duì)阿特拉津的降解效果，出現(xiàn)降解率下降現(xiàn)象。

2.1.5 鹽度隨著鹽度升高，阿特拉津的降解率呈先上升后下降趨勢(shì)。菌株降解阿特拉津的適宜鹽度為0.1%～1%，在0.5%鹽度時(shí)阿特拉津降解率最高，為96%；高鹽（3%鹽度）明顯抑制阿特拉津的降解作用。當(dāng)培養(yǎng)基中鹽度高于菌體細(xì)胞時(shí)可直接引起細(xì)胞失水，導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)輸系統(tǒng)受損或使生物酶失活，影響菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，造成阿特拉津降解率降低［27］。

2.1.6 碳源各碳源對(duì)阿特拉津降解率的影響依次為葡萄糖＞果糖＞檸檬酸鈉＞乳糖＞蔗糖＞淀粉。其中，葡萄糖為碳源的降解率最高，達(dá)97%；淀粉為碳源的降解率最低，為90%。表明，菌株可利用的碳源種類較寬，且利用能力較強(qiáng)。因此，碳源對(duì)阿特拉津降解效果的影響不大。

2.2 阿特拉津降解條件優(yōu)化

從表1可見(jiàn)，A2B1C1、A2B2C2組合處理的降解率最高，分別達(dá)80.34%和76.26%，二者間差異不顯著。進(jìn)一步極差分析得出，菌株降解阿特拉津的最佳組合條件為A2B2C2（表2），即：溫度30℃、pH 7.0、鹽度0.5%時(shí)，阿特拉津的降解效果最好。3個(gè)因素對(duì)阿特拉津降解的影響依次為溫度＞pH＞鹽度。

表1 阿特拉津降解條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其降解率Table1 Design and degradation rate of the orthogonal test for Atrazine degradation conditions

表2 阿特拉津降解條件正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析Table2 Range analysis of orthogonal test results for Atrazine degradation conditions

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)菌株在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)48h對(duì)阿特拉津的降解率超過(guò)90%，表明，其是理想的高效降解菌株。因此，本研究豐富了阿特拉津降解的微生物資源。

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株降解阿特拉津的培養(yǎng)條件分別為培養(yǎng)時(shí)間48h，底物濃度100mg／L，溫度25～35℃，pH 5.0～8.0，鹽度0.1%～1%。碳源利用試驗(yàn)表明，菌株有較寬的碳源利用譜，碳源對(duì)阿特拉津降解效果的影響不大。

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株降解阿特拉津的最佳組合條件為溫度30℃，pH 7.0，鹽度0.5%，且3個(gè)因素對(duì)降解效果的影響依次為溫度＞pH＞鹽度。

［1］SENE L，CONVERTI A，SECCHHI G A R，et al.New aspects on atrazine biodegradation［J］.Brazilian Archives of Biology anDTechnology，2010，53（2）：487－496.

［2］SMITH D，ALVEY S，CROWLEY D E.Cooperative catabolic pathways within an atrazine－degrading enrichment culture isolated from soil［J］.Federation of European Microbiological Societies Microbiology Ecology，2005，53：265－273.

［3］周寧，孟慶娟，王榮娟，等.除草劑阿特拉津微生物降解研究進(jìn)展［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39（9）：136－139.

［4］KADIAN N，GUPTA A，SATYA S，et al.Biodegradation of herbicide（atrazine）in contaminated soil using various bioprocessed materials［J］.Bioresource Technology，2008，99（11）：4642－4647.

［5］LIU C，HUANG X，WANG H.Start－up of a membrane bioreactor bio－augmented with genetically engineered microorganism for enhanceDTreatment of atrazine containing wastewater［J］.Desalination，2008，231（1－3）：12－19.

［6］李紹峰，朱靜，李鐵晶.阿特拉津降解菌株的分離堯鑒定及降解特性研究［J］.環(huán)境科學(xué)，2012，33（9），3214－3219.

［7］YANG C，LI Y，ZHANG K，et al.Atrazine degradation by a simple consortium of Klebsiella sp.A1and Comamonas sp.A2in nitrogen enriched medium［J］.Biodegradation，2010，21：97－105.

［8］WACKETT L P，SADOWSKY M J，MARTINEZ B，et al.Biodegradation of atrazine and related s－triazine－compounds：from enzymes to field studied［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2002，58（1）：39－45.

［9］王輝，趙春燕，李寶明，等.微生物降解阿特拉津的研究進(jìn)展［J］.土壤通報(bào)，2005，36（5）：791－794.

［10］FREITASL G，SINGER H，MüLLER S R，et al.Source area effects on herbicide losses to suiface waters－A case study in the Swiss Plateau［J］.Agriculture，Ecosystems＆Environment，2008，128（3）：177－184.

［11］吳衛(wèi)東，周馳，郭晉君，等.高壓液相色譜法測(cè)定地表水和飲用水中的阿特拉津［J］.干旱環(huán)境監(jiān)測(cè)，2011，25（1）：1－3，8.

［12］HAYES T.Hermaphroditic，demasculinized frogs after exposure to the herbicide，atrazine，at low ecologically relevant doses［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2002，99：5476－5480.

［13］SAFE S.Clinical correlates of environmental endocrine disruptors［J］.Trends in Endocrinology and Metabolism，2005，16（4）：139－144.

［14］GU RIT I，BOCQUEN G，JAMES A，et al.Environmental risk assessment：A critical approach of the European TGD in an insitu application［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，2008，71（1）：291－300.

［15］李清波，黃國(guó)宏，王顏紅.阿特拉津生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)及其檢測(cè)和修復(fù)技術(shù)研究進(jìn)展［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，13（5）：625－628.

［16］WIEGAND C，KRAUSE E，STEINBERG C，et al.Toxicokinetics of atrazine in embryos of the zebrafish（Danio rerio）［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，2001，49：199－205.

［17］MACLENNAN PA，DELZELL E，SATHIAKUMAR N，et al.Cancer incidence among triazine herbicide manufacturing workers［J］.Journal of Occupational and Environmental Medicine，2002，44：1048－1058.

［18］BETHSASS J，COLANGELO A.European Union bans atrazine，while the United States negotiates continued use［J］.International Journal of Occupational and Environmental Health，2006，12：260－267.

［19］崔燕玲，劉丹丹，劉長(zhǎng)風(fēng)，等.土壤農(nóng)藥污染的微生物修復(fù)研究概況［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（16）：75－76，79.

［20］UDIKOVI －Koli N，SCOTT C，MARTIN－Laurent F.Evolution of atrazine－degrading capabilities in the environment［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2012，96：1175－1190.

［21］CAI B，HAN Y，LIU B，et al.Isolation and characterization of an atrazine－degrading bacterium from industrial wastewater in China［J］.Letters in Applied Microbiology，2003，36（5）：272－276.

［22］SINGH P，SURI C R，CAMEOTR S S.Isolation of a member of Acinetobacter species involved in atrazine degradation［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2004，317（3）：697－702.

［23］SAJJAPHAN K，SHAPIR N，WACKETT L P，et al.Arthrobacte raurescens TC1atrazine catabolism genes trzN，atzB，and atzC are linked on a160－kilobase region and are functional in Escherichia coli［J］.Applied and Environmental Microbiology，2004，70（7）：4402－4407.

［24］張慧芳，冉夢(mèng)蘭，汪倩，等.草甘膦微生物降解菌株的篩選及其生物學(xué)特性［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：111－115.

［25］胡秀虹，張廷輝，湯承浩，等.阿維菌素降解菌的誘變選育及降解特性［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11）：102－104.

［26］SOLOMON R D J，KUMAR A，SATHEEJA S V.Atrazine biodegradation efficiency，metabolite detection，anDTrzD gene expression by enrichment bacterial cultures from agricultural soil［J］.Journal of Zhejiang University－SCIENCE B（Biomedicine ＆Biotechnology），2013，14（12）：1162－1172.

［27］王靜，李迎芳，裴麗娟，等.水中阿特拉津的自動(dòng)固相萃取－高效液相色譜法測(cè)定［J］.河南科學(xué)，2013，31（2）：165－167.

［28］鄭柳柳，袁博，朱希坤，等.阿特拉津降解菌株的分離、鑒定和工業(yè)廢水生物處理試驗(yàn)［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2009，36（7）：1099－1104.

［29］張慶媛，葛世杰，姜昭，等.高效阿特拉津降解菌株DNS10降解條件優(yōu)化［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2013，7（3）：1169－1174.

（責(zé)任編輯：王 海）

Optimization for Degradation Conditions of a Pseudomonas sp.Strain with Degrading Atrazine Ability

LIU Dandan，LIU Chang，LIU Changfeng，LI Xinyan
（Department of Environmental and Safety Engineering，Shenyang University of Chemical Technology，Shenyang，Liaoning110142，China）

The degrading Atrazine effect of a Pseudomonas sp.strain screened from the soil polluted with Atrazine for long time was studied under different culture conditions by the single－factor test anDThe degradation conditions were optimized by the orthogonal test to provide a reference for application of microbial degradation bacteria in restoration works of soil polluted with pesticides.Results：Carbon source has no obvious effect on degradation effect.The Atrazine degradation rate of the Pseudomonas sp.strain is more than 90%under the culture conditions of 48h，100mg／L substrate concentration，25～35℃，pH 5.0～8.0and 0.1%～1%salinity.The optimal condition combination of the Pseudomonas sp.strain includes 30℃，pH 7.0and 0.5%salinity anDThe influencing degree is temperature＞pH＞salinity.

Pseudomonas sp.；microbial degradation bacteria；Atrazine；pesticide residue；environmental pollution；degradation ability

S154.39；X172

A

1001－3601（2016）10－0421－0046－04

2016－04－14；2016－10－09修回

遼寧省博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目“土壤阿特拉津污染的微生物修復(fù)機(jī)制與工程菌株構(gòu)建”（20141086）

劉丹丹（1981－），女，講師，博士，從事環(huán)境污染控制與修復(fù)研究。E－mail：liudandan.553＠163.com