北蟲草液體菌種的最佳培養(yǎng)時(shí)間

王殿振，任桂梅，2，趙瑞華，2，房云云，賀曉龍，2＊，劉月芹

（1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安716000；2.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，陜西延安716000）

北蟲草液體菌種的最佳培養(yǎng)時(shí)間

王殿振1，任桂梅1，2，趙瑞華1，2，房云云1，賀曉龍1，2＊，劉月芹1

（1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安716000；2.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，陜西延安716000）

為了探究北蟲草液體菌種培養(yǎng)過程中相關(guān)酶活性與其生長(zhǎng)發(fā)育及菌種活力之間的關(guān)系，確定較佳液體菌種培養(yǎng)時(shí)間，進(jìn)行北蟲草液體菌種培養(yǎng)過程中淀粉酶活性、纖維素酶活性、還原糖含量和菌絲干重等的研究。結(jié)果表明：北蟲草培養(yǎng)第5天時(shí)菌絲增重速率達(dá)最大；培養(yǎng)前7d還原糖代謝基本平衡，7d后下降加快；纖維素酶活性在第3天時(shí)達(dá)到最大；淀粉酶活性在第4天時(shí)達(dá)到最大。北蟲草較佳液體菌種培養(yǎng)時(shí)間為5d。

北蟲草；纖維素酶；淀粉酶；菌絲干重；還原糖

北蟲草（Cordyceps militariSL.）又名北冬蟲夏草、蛹蟲草［1］和蟲草花，其草長(zhǎng)5～8cm，屬子囊菌亞門麥角菌科蟲草屬［2］，金黃或桔黃色，是寄生在鱗翅目和鞘翅目等昆蟲蛹體上的真菌［3］，與冬蟲夏草同屬異種［4］，主要生長(zhǎng)于我國(guó)北方地區(qū)。北蟲草為珍稀中藥材，其不僅含有蟲草素、蟲草酸［5］、豐富的蛋白質(zhì)、各種氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還含有30多種人體所需的微量元素，具有滋肺補(bǔ)腎、止血化痰、擴(kuò)張氣管、鎮(zhèn)靜、抗各類細(xì)菌、降血脂［6］等功效，是上等的滋補(bǔ)佳品。此外，北蟲草作為一種重要的林下藥用資源，富含多核苷、多糖、生物堿、甾醇、環(huán)狀縮羧肽等多種活性物質(zhì)［7］，且具有抗腫瘤［8－9］、抗菌［10］消炎［11］、抗氧化／衰老、抗纖維化、抗轉(zhuǎn)移、抗疲勞、改善胰島素分泌／保肝、調(diào)節(jié)免疫［12］等藥理作用。液體深層發(fā)酵具有發(fā)酵效率高，操作方便，成本低、勞動(dòng)強(qiáng)度低、占地面積小和產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)［13－14］，蟲草的液體深層發(fā)酵已有一定的研究［15－20］，但大多研究工作主要集中于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等方面，而對(duì)于北蟲草培養(yǎng)周期的研究較少。因此，筆者等對(duì)北蟲草液體深層發(fā)酵過程中的胞外酶活性、還原糖含量及菌絲干重為指標(biāo)，研究分析其生理生長(zhǎng)規(guī)律，確定得最佳培養(yǎng)周期，為北蟲草進(jìn)一步的生理生化研究和菌種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：北蟲草菌種Cs－1，由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食用菌實(shí)驗(yàn)室提供。

藥品：包括3，5－二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉等。

儀器：ALP全自動(dòng)式高壓滅菌鍋，SKY－2102C雙層恒溫?fù)u床，UV－2600分光光度計(jì)PYX－DHS－60X75－BS恒溫培養(yǎng)箱，SHB－3A循環(huán)水多用真空泵，AUY220電子天平等。

1.2 培養(yǎng)基的配制及液體菌種培養(yǎng)

母種培養(yǎng)基：稱取洋蔥200g，切片，沸水煮30min，8層紗布過濾，取濾液，加入葡萄糖20g、酵母膏5g、磷酸二氫鉀1.5g、硫酸鎂0.5g、瓊脂15g、維生素B110mg，加熱充分溶解，定容至1 000mL，分裝試管，10mL／管，121℃，30min高壓滅菌，無菌檢驗(yàn)，確認(rèn)無菌后備用。

液體培養(yǎng)基：稱取洋蔥600g，切片，沸水煮30min，8層紗布過濾，取濾液，加入葡萄糖20g、酵母膏5g、磷酸二氫鉀1.5g、硫酸鎂0.5g、維生素B110mg，加熱充分溶解，定容至3 000mL，裝入三角瓶（規(guī)格為150mL），50mL／瓶，121℃，30min滅菌，完成后取出備用。

液體菌種培養(yǎng)：取出斜面菌株，刮下菌絲片段［21］制成菌懸液，注射于液體培養(yǎng)基中，每瓶注射1mL，20℃恒溫靜置培養(yǎng)1d后，取出放入搖床，溫度為20℃，轉(zhuǎn)速為180r／min，培養(yǎng)9d。

1.3 試劑配制

DNS試劑的配制參照王俊麗等［22］的方法，檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液配制參照王修齊等［23］的方法。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制為準(zhǔn)確稱取葡萄糖1.0g，以蒸餾水定容至1 000mL。麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制為準(zhǔn)確稱取麥芽糖1.0g，以蒸餾水定容至1 000mL。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線均按表1方法配制溶液，沸水浴5min，取出迅速放入冷水中，降到室溫時(shí)，加蒸餾水定容至25mL，搖勻。1號(hào)試管為空白對(duì)照，葡萄糖在波長(zhǎng)550nm處測(cè)定，麥芽糖在波長(zhǎng)520nm處測(cè)定，分別以葡萄糖含量和麥芽糖含量為橫坐標(biāo)，光密度值為縱座標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

表1 葡萄糖和麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成分及用量Table1 Composition anDThe dosage in standard solutions of glucose and maltose

表2 還原糖含量測(cè)定Table2 Reducing sugar content determination

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard carves of glucose and maltose

1.5 測(cè)定項(xiàng)目和方法

1.5.1 菌絲體干重菌絲體干重采用烘干稱重法測(cè)定。

1.5.2 還原糖含量將表2配好的各溶液混合，沸水浴5min，取出迅速放入冷水中，降到室溫時(shí)，加蒸餾水定容至25mL，搖勻，在波長(zhǎng)550nm處測(cè)定，還原糖含量取平均值，每天重復(fù)測(cè)定。1號(hào)試管作為空白對(duì)照。

1.5.3 淀粉酶活性的測(cè)定取6支25mL具塞刻度試管，各加入按表2配制的濾液0.10mL，1號(hào)試管沸水浴15min作為對(duì)照組，再向各試管加入pH 5.6的檸檬酸緩沖液1.90mL，搖勻，于40℃的水浴鍋中水浴15min后取出。各加入1.00mol／mL的淀粉溶液1mL，40℃水浴中準(zhǔn)確保溫5min，然后向試管中加入0.4mol／L的NaOH溶液。分別取各試管溶液2mL，并分別加入DNS試劑3mL，混勻，置沸水浴中5min，取出迅速冷卻，用蒸餾水稀釋至25mL，混勻，于波長(zhǎng)520nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算麥芽糖含量。

1.5.4 纖維素濾紙酶活性的測(cè)定取6支25mL具塞刻度試管，各加入濾液0.10mL，1號(hào)試管沸水浴15min作為對(duì)照組，再向各試管加入pH 4.5的檸檬酸緩沖液1.90mL，搖勻，于50℃的水浴鍋中水浴8min后取出。各加入一張50mg的濾紙條，50℃水浴中準(zhǔn)確保溫1h后分別加入DNS試劑3mL，混勻，置沸水浴中5min，取出迅速冷卻，用蒸餾水稀釋至25mL，混勻，于波長(zhǎng)550nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖含量，以后每天重復(fù)上述操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲干重的變化

從圖3看出，第1～3天菌絲干重增加不明顯，第4～8天菌絲干重增重較快，第5天時(shí)菌絲增重速率達(dá)最大，第8天菌絲干重達(dá)到最大?？芍毕x草的菌絲干重隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，其生長(zhǎng)曲線呈“S”型，表現(xiàn)出典型的適應(yīng)期、對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期和穩(wěn)定期［16］。第9天菌絲干重稍微降低，可能是菌絲出現(xiàn)了自溶現(xiàn)象。

圖2 北蟲草液體培養(yǎng)的菌絲干重Fig.2 Mycelial dry weight of C.militaris in liquid culture

2.2 還原糖含量

從圖4看出，還原糖的含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加逐步減少，在3～6d下降速度較慢，7～9d下降速度較快。還原糖前期下降較慢，后期較快原因可能是在北蟲草生長(zhǎng)初期還原糖代謝相對(duì)平衡，7d后淀粉酶與纖維素酶等的活力開始下降，代謝失衡，還原糖生成速度小于消耗所致。

圖3 北蟲草液體培養(yǎng)的還原糖含量Fig.3 Reducing sugar content of C.militaris in liquid culture

2.3 淀粉酶活性的的變化

由圖5看出，第1～2天麥芽糖呈下降趨勢(shì)，原因可能是在培養(yǎng)基中本來就含有一定的麥芽糖，初期菌絲直接利用已有的還原糖，淀粉酶沒有或很少參與代謝活動(dòng)；第2～4天麥芽糖呈上升趨勢(shì)，原因可能是當(dāng)培養(yǎng)基中的還原糖含量降到一定程度時(shí)，淀粉酶代謝活動(dòng)逐漸旺盛，分解淀粉產(chǎn)生大量還原糖，使之含量增加；第4天后呈下降趨勢(shì)，至第8天時(shí)降到最低，原因可能是后期營(yíng)養(yǎng)降低，菌絲老化，淀粉酶活性降低所致。第8天后又略有上升，原因可能是雜菌感染或者操作失誤，具體原因在以后的研究中進(jìn)一步探討。

2.4 纖維素酶活性的的變化

由圖6可知，葡萄糖的濃度在第1～3天呈上升趨勢(shì)，且在第3天達(dá)最大值，之后總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，原因可能是前3d培養(yǎng)條件適宜，營(yíng)養(yǎng)豐富，酶活性逐漸升高，葡萄糖的產(chǎn)生速率大于消耗速率，出現(xiàn)葡萄糖升高的現(xiàn)象；第3天后菌絲代謝產(chǎn)生部分次生代謝產(chǎn)物抑制了酶活性，加之營(yíng)養(yǎng)降低，導(dǎo)致了酶活性逐漸降低，葡萄糖的產(chǎn)生速率小于消耗速率，出現(xiàn)葡萄糖逐漸降低的現(xiàn)象。

圖4 北蟲草液體培養(yǎng)麥芽糖濃度的變化Fig.4 Maltose concentration variation of C.militaris in liquid culture

圖5 北蟲草液體培養(yǎng)葡萄糖濃度的變化Fig.5 Glucose concentration variation of C.militaris in liquid culture

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果初步表明，北蟲草胞外酶活性與其生理生長(zhǎng)密切相關(guān)，北蟲草液體培養(yǎng)過程中淀粉酶活性最大時(shí)間為第4天，纖維素酶活性最大時(shí)間為第3天，菌絲干重增長(zhǎng)速度最大時(shí)間為第5天，還原糖的量在前7d還原糖代謝基本平衡，7d后下降加快。綜合考慮，北蟲草液體菌種培養(yǎng)時(shí)間為5d較佳。該結(jié)果可為北蟲草液體培養(yǎng)提供一定的理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：聶克艷）

Optimum Culture Period of Cordyceps militarisLiquid Spawn

WANG Dianzhen1，REN Guimei1，2，ZHAO Ruihua1，2，F(xiàn)ANG Yunyun1，HE Xiaolong1，2＊，LIU Yueqin1
（1.College of Life Sciences，Yan’an University，Yan’an，Shaanxi 716000；2.Engineering Technology Research Center for Conservation and Utilization of Biological Resources in Shaanxi Province，Yan＇an，Shaanxi 716000，China）

In order to clarify the relationship between related enzyme activity and growth and strain activity of C.militaris in liquid culture，the authors studied amylase activity，cellulase activity，reducing sugar content and mycelial dry weight in the process of C.militariSLiquid culture.Results：Mycelium growth rate reacheDThe maximum on the fifth day，reducing sugar metabolism maintained a basic balance in the first seven days and reduced rapidly seven daySLater，the cellulase activity reacheDThe maximum on the third day，anDThe amylase activity reacheDThe maximum on the forth day.In summary，optimal C.militariSLiquid culture period is the fifth day.

Cordyceps militaris；cellulase；amylase；dry weight of mycelium；reducing sugar

S567.3＋5

A

1001－3601（2016）10－0427－0070－04

2016－07－14；2016－10－11修回

陜西科技廳協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目“陜北能源化工基地石油廢棄物無害化生物修復(fù)處理關(guān)鍵技術(shù)研究”（2015XT－34）；陜西省教育廳科研項(xiàng)目“延安地區(qū)北蟲草菌種分離與復(fù)壯研究”（15JK1815）；延安大學(xué)研究生教育創(chuàng)新項(xiàng)目“北蟲草菌種分離與復(fù)壯方法的篩選研究”

王殿振（1989－），男，在讀碩士，研究方向：應(yīng)用微生物及食用真菌學(xué)。E－mail：340680760＠qq.com

＊通訊作者：賀曉龍。E－mail：254441886＠qq.com