何首烏提取物對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用

楊旭 ，趙海洲，徐大德，羅展遠，朱晶，劉文華，貝偉劍

(1.廣東藥學院 中醫藥研究院，廣東 廣州 510006; 2.肇慶學院 生命科學學院，廣東 肇慶 526061)

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何首烏提取物對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用

楊旭1，趙海洲2，徐大德2，羅展遠1，朱晶1，劉文華2，貝偉劍1

(1.廣東藥學院 中醫藥研究院，廣東 廣州 510006; 2.肇慶學院 生命科學學院，廣東 肇慶 526061)

摘要:目的 研究何首烏提取物對1-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)誘導SH-SY5Y細胞損傷的保護作用。方法 體外培養SH-SY5Y細胞，建立MPP+致SH-SY5Y細胞損傷模型，實驗分為對照組、MPP+損傷模型組、何首烏提取物干預組。干預組在MPP+損傷的基礎上，給予不同濃度何首烏提取物(終質量濃度5、25、100 mg/L)。MTT比色法檢測細胞活力；Hoechst33258染色和白光下觀察細胞形態變化，比色法檢測細胞培養上清液中乳酸脫氫酶(LDH)及細胞中丙二醛(MDA)含量；通過熒光強度觀察活性氧(ROS)的含量和線粒體膜電位的變化。結果 與對照組相比，模型組中細胞活性顯著降低，Hoechst33258染色和白光下可見細胞胞體變小、核皺縮、碎裂有明顯的顆粒狀和固縮狀熒光，并且細胞上清液中LDH泄漏明顯增多、細胞中MDA含量和ROS顯著升高而線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，預先4 h給予不同濃度的何首烏提取物(5、25、100 mg/L)能明顯改善SH-SY5Y細胞的活性，降低細胞產生的LDH、MDA含量，并恢復線粒體膜高能電位,且對ROS有明顯的抑制效果(P<0.01)。結論 何首烏提取物對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷具有顯著的保護作用，其保護作用與其抗氧化應激作用有關。

關鍵詞:何首烏提取物； SH-SY5Y細胞； MPP+細胞損傷； 神經保護

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的神經退行性疾病。主要病理特征的改變是黑質致密區多巴胺神經元的缺失[1]。其臨床上主要表現為靜止性震顫、肌肉僵直、運動遲緩和姿勢反射障礙等[2]。迄今為止PD發生的機理還不是很清楚，一般認為線粒體功能紊亂、氧化應激、內質網應激、神經炎癥等是PD發生的主要因素[3]。目前臨床用于治療PD的藥物均只對發病過程中的某一或某幾個環節起效，且副作用大。中藥在防治PD等老年性疾病方面有豐富的實踐經驗，且毒性相對較小，越來越受到醫藥界的關注和推崇[4]。

傳統中藥何首烏Fallopiamultiflora(Thunb.) Harald.常以生首烏或制首烏入藥，生首烏味苦、甘、澀、微溫,具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便之功效。生首烏經炮制后即成為制首烏,制首烏味苦、甘、澀、微溫,歸肝、心、腎經,具有補肝腎、益精血、壯筋骨、烏須發、化濁降脂之效。有研究表明何首烏具有一定的神經保護作用[5]。本研究擬通過1-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)誘導SH-SY5Y細胞的PD模型探討何首烏提取物(extract ofPolyyonummultiflorm,EPM)對其是否具有保護作用及其可能的機制，為尋找安全有效的中藥提供實驗依據。

1材料與儀器

SH-SY5Y細胞株購自中山大學細胞庫；何首烏藥材購自廣州致信藥業有限公司,經廣東藥學院中藥學院曾令杰教授鑒定為中藥材何首烏；胰酶、FBS、L-Glutamine(100×，GIBCO)；青鏈霉素混合液(100×，北京索萊寶)；PBS(Hycione)；MPP+、MTT(Sigma)；Hochest33258(Roche)；丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(南京建成)；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、活性氧(ROS)檢測試劑盒(碧云天)。

2方法

2.1EPM的制備及成分分析

稱取1 000 g何首烏藥材，粉碎過24目篩，加10倍藥材量的50%(φ)乙醇，加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液。提取液用300目篩過濾，然后濃縮至約1 mL/g。濃縮液再過大孔樹脂吸附，用6倍柱體積70%(φ)乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮后60 ℃真空干燥48 h。得EPM后采用HPLC進行檢測和用二甲基亞砜(DMSO，體積分數<0.01%)溶解，用DMEM培養液配成各濃度用于實驗。

2.2細胞培養及分組

將SH-SY5Y細胞接種于DMEM完全培養基(10%FBS、1%青鏈霉素混合液、1%L-Glutamine)中、于5%(φ)CO2、37 ℃培養箱中培養。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀況，2～3 d更換1次培養基。待細胞長到80%～90%時按1∶2～1∶3進行傳代。選取處于生長對數期的細胞進行實驗。將細胞分成對照組(加入干預組等量的無血清的DMEM培養液)、MPP+損傷模型組、EPM低、中、高劑量組(終質量濃度5、25、100 mg/L)。

2.3細胞形態觀察

SH-SY5Y細胞消化成細胞懸液后，分別以2×105/孔和5×104/孔的細胞密度接種于6孔培養板及放有玻片(多聚賴氨酸包被過夜)的24孔培養板中，培養24 h后以不同濃度的EPM(5、25、100 mg/L)預培養4 h，4 h后加0.5 mmol/L MPP+培養48 h。6孔板細胞在倒置顯微鏡白色光視野下觀察、拍照。24孔板細胞吸去培養液后，用PBS清洗3遍。加入新鮮的4%(φ)多聚甲醛固定10 min。PBS清洗3遍后加入5 mg/L的Hoechst33258染色液，室溫作用10 min后用PBS漂洗，然后封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2.4MTT法對細胞活性的檢測

SH-SY5Y細胞消化成細胞懸液后，以1×104/孔細胞的密度接種于96孔培養板中，每組設置5個復孔，培養24 h。分別給予不同濃度的MPP+后在5%CO2、37 ℃培養箱中分別培養24 h和48 h，確定MPP+的最佳濃度和時間。為了檢測EPM對SH-SY5Y細胞存活率的影響，并確定提取物的無毒濃度范圍，選用了1～500 mg/L之間的8個濃度點，作用于SH-SY5Y細胞48 h。在培養結束前4 h時加入5 mg/L的MTT置于培養箱中培養4 h。吸去培養基，每孔加入150 μL的DMSO。置于搖床(45 r/min)上震蕩10 min，使結晶物完全溶解。用酶聯免疫檢測儀于570 nm波長處測定其吸光度值(A)。通過比較來確定最佳的MPP+的給藥濃度、時間和EPM最適的給藥濃度范圍。設對照組細胞生長率為100%，模型組和干預組的細胞存活率用以下公式計算：細胞存活率=A實驗組/A對照組×100%。

2.5比色法檢測細胞中MDA和上清液中LDH含量

SH-SY5Y細胞以2×105/孔的密度接種于6孔培養板中，不同濃度的EPM(5、25、100 mg/L)預培養4 h，4 h后加0.5 mmol/L MPP+培養48 h。分別按MDA和LDH測定試劑盒說明書操作，比色法測定細胞中MDA和細胞上清液中LDH水平。

2.6細胞ROS的檢測

SH-SY5Y細胞以5×104/孔的密度接種于放有玻片(多聚賴氨酸包被過夜)的24孔培養板中，不同濃度的EPM(5、25、100 mg/L)預培養4 h，4 h后加0.5 mmol/L MPP+培養48 h。用10 μmol/L的DCFH-DA工作液作用于細胞。在37 ℃細胞培養箱中孵育20 min。用無血清的培養基清洗3次。熒光顯微鏡拍照并測定其熒光強度。

2.7細胞線粒體膜電位檢測

SH-SY5Y細胞以5×104/孔的密度接種于放有玻片(多聚賴氨酸包被過夜)的24孔培養板中，不同濃度的EPM(5、25、100 mg/L)預培養4 h，4 h后加0.5 mmol/L MPP+培養48 h。棄去培養液，PBS洗3次。加入0.5 mL無血清的培養基和0.5 mL的JC-1工作液混勻，細胞培養箱中37 ℃孵育20 min。結束后，用JC-1染色緩沖液洗滌2次。用熒光顯微鏡拍照測定其熒光強度。計算紅色與綠色熒光比值。

2.8統計學處理

3結果

3.1EPM的成分分析

1 000 g何首烏藥材經過上述工藝處理后得EPM 95 g。經HPLC檢測EPM含二苯乙烯苷29.5%，游離蒽醌2.1%，結合蒽醌5.2%。見圖1。

1000750500250-20014001020304050600t/min

峰4.二苯乙烯苷； 峰5.蘆薈大黃素； 峰6.大黃酸； 峰7.大黃素； 峰8.大黃酚； 峰9.大黃素甲醚； 紅色1為二苯乙烯苷+總蒽醌混合對照品圖； 黑色2為EPM樣品圖。

圖1何首烏提取物HPLC特征圖譜

Figure 1HPLC specific chromatogram of EPM

3.2細胞形態觀察

在倒置顯微鏡下觀察發現，傳代的SH-SY5Y細胞培養4 h左右貼壁，起初呈梭型或橢圓形，24 h后胞體出現樹枝狀突起，胞體圓潤且胞間的突起相互連接。經0.5 mmol/L MPP+作用48 h后，模型組細胞胞體變小，出現小斑點，軸突消失，細胞皺縮。與模型組相比，EPM干預組細胞形態得到明顯改善，并呈一定劑量依賴性，高劑量組細胞形態接近于對照組。通過Hoechst 33258染色比較，對照組呈現出低強度均勻彌散的藍色熒光，細胞核邊緣整齊；模型組細胞核皺縮、凝聚和碎裂，并呈現出亮藍色的典型凋亡小體；與模型組比較，EPM低、中、高劑量組的細胞核形態得到明顯改善，核固縮和亮藍色的凋亡小體減少，其中高劑量組的細胞核形態與對照組形態更為接近。見圖2。

3.3MTT法對SH-SY5Y細胞存活率的檢測

3.3.1MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷所需濃度和時間的確定與對照組比較，不同濃度的MPP+藥物均可對SH-SY5Y細胞有不同程度的抑制作用，隨著MPP+藥物濃度和時間的增加，對SH-SY5Y細胞的抑制作用增強，結果見表1。經0.5 mmol/L MPP+作用48 h后，細胞存活率下降至對照組的44.7%，本實驗用此濃度和作用時間作為模型組建立條件。

A～E為白光下的細胞形態圖； F～J是經過Hoechst 33258染色后熒光拍攝圖。

A、F. 對照組； B、G. 模型組； C、H. 低劑量組； D、I. 中劑量組； E、J. 高劑量組。

圖2各組SH-SY5Y細胞的形態學觀察

Figure 2Morphology of SH-SY5Y cells in each group

3.3.2EPM對SH-SY5Y細胞活性的影響和對照組相比，提取物在1～100 mg/L濃度范圍內對細胞活性無明顯影響，表明提取物低于100 mg/L是安全濃度范圍。而200、500 mg/L的提取物作用后，細胞存活率下降至約65%，表明達到200 mg/L濃度會對細胞產生毒性作用(圖3)。因此下面的實驗中選用5、25、100 mg/L 3個劑量來檢測提取物對SH-SY5Y細胞的保護作用。

表1不同濃度的MPP+24 h和48 h對SH-SY5Y細胞存活率的影響

Table 1Effect of MPP+at different concentrations on cell viability at 24 and 48 h

組別c/(mmol·L-1)細胞存活率/%24h48h對照組-100±0.5100±0.4 MPP+組0.187.7±0.374.6±1.2**0.2580.1±0.2*63.0±0.80.579.7±0.2*44.7±0.6*175.9±0.3**32.1±0.3**277.9±0.1**30.0±0.2*547.5±0.3**23.8±0.7*

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

120100806040200細胞存活率/%10020050015102550對照組ρ(EPM)/(mg?L-1)

圖3不同濃度的EPM對SH-SY5Y細胞存活率的影響

Figure 3 Effect of EPM on the viability of SH-SY5Y cells

3.3.3EPM物對MPP+引起的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用模型組SH-SY5Y細胞經0.5 mmol/L MPP+作用24 h后，細胞存活率下降至對照組的44.7%。與模型組相比，EPM低、中、高劑量組(5、25、100 mg/L)顯著提高SH-SY5Y細胞存活率，分別為63.8%、76.1%、88.9%(圖4)。提示EPM在一定濃度范圍內能劑量相關地改善MPP+損傷的SH-SY5Y細胞活性。

3.4EPM對SH-SY5Y細胞MDA水平的抑制作用

與對照組比較，模型組中SH-SY5Y細胞經過0.5 mmol/L MPP+處理之后，細胞內MDA水平顯著升高(P<0.01)，約為對照組的2.2倍。和模型組比較，EPM低、中、高劑量組(5、25、100 mg/L)能顯著降低SH-SY5Y細胞中MDA水平，分別為模型組的85.0%、75.0%(P<0.05)和60.0%(P<0.01)(圖5A)。實驗結果提示，在一定濃度范圍內EPM能夠抑制MPP+引起的SH-SY5Y細胞MDA水平升高，并具有劑量依賴性。

120100806040200細胞存活率/%對照組模型組525100ρ(EPM)/(mg?L-1)

與對照組比較：*P<0.01，與模型組比較：#P<0.05。

圖4EPM對MPP+引起的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用

3.5EPM對SH-SY5Y細胞LDH水平的抑制作用

與對照組比較，模型組中SH-SY5Y細胞LDH水平升高至對照組的1.8倍(P<0.01)。與模型組比較，EPM低、中、高劑量組(5、25、100 mg/L)能顯著降低SH-SY5Y細胞中LDH水平，分別下降至模型組的88.8%、86.2%(P<0.05)和69.3%(P<0.01)(圖5B)。由此可見，EPM能夠劑量依賴性抑制MPP+引起的SH-SY5Y細胞LDH水平上升。

3.6EPM對SH-SY5Y細胞內ROS的影響

各組細胞運用熒光探針DCFH-DA裝載之后，與對照組相比，模型組SH-SY5Y細胞內二氯熒光素(DCF)信號顯著增強，ROS的水平大幅度的增加，熒光強度明顯增強，與模型組相比，EPM低、中、高劑量組(5、25、100 mg/L)可明顯抑制MPP+損傷的細胞ROS的產生，熒光強度明顯降低(圖6)。結果表明，EPM能有效抑制MPP+引起的SH-SY5Y細胞內ROS水平上升。

3.7EPM對MPP+誘導的線粒體膜電位的影響

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的熒光探針，在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體基質中形成聚合物，產生紅色熒光。在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體基質中，此時JC-1為單體，產生綠色熒光。通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。與對照組比較，模型組細胞中的熒光顏色顯著變為綠色，表明線粒體膜電位下降，EPM低、中、高劑量組(5、25、100 mg/L)與模型組比較，紅色熒光增強，綠色熒光減弱，且呈劑量依賴性(圖7)，表明EPM能明顯抑制MPP+引起的線粒體膜電位下降，進而修復MPP+誘導損傷的線粒體。

250200150100500MDA含量百分比/%對照組模型組525100200180160140120100806040200LDH泄漏百分比/%對照組模型組525100ρ(EPM)/(mg?L-1)ρ(EPM)/(mg?L-1)BA

與對照組比較：*P<0.01；與模型組比較：#P<0.05。

A. EPM抑制MPP+引起的SH-SY5Y細胞MDA升高；

B. EPM物抑制MPP+引起的SH-SY5Y細胞LDH泄漏增加。

圖5EPM抑制MPP+引起的SH-SY5Y細胞MDA升高和LDH泄漏增加

4討論

目前普遍認為PD是由于中腦黑質致密部多巴胺(DA)神經元發生退行性死亡，并導致紋狀體中DA遞質含量減少而發生的。怎樣防止多巴胺能神經元的退行性病變、損傷從而緩解甚至逆轉PD的進程，已成為國內外有關PD治療的研究重點和熱點[6]。MPP+是MPTP的代謝產物，對多巴胺能神經元具有較強的選擇性，可以導致人類黑質DA能神經元產生病理損傷，并出現近似PD的癥狀。故本實驗采用MPP+為誘導劑，以人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y細胞)為模型載體。制備擬PD細胞模型，該模型是國內外常用且經典的PD體外模型[7]。

何首烏是蓼科植物何首烏的干燥塊根。塊根作為其主要的藥用部分含有蒽醌、黃酮、二苯乙烯苷、脂肪酸、卵磷脂和一些微量元素等[8]。現代中藥藥理研究發現，何首烏的重要有效成分：二苯乙烯苷對神經退行性疾病主要是通過抗氧化途徑,清除體內自由基而發揮保護作用[9],進而可以減輕β-amyloid protein誘導的神經細胞凋亡,改善AD、PD等神經退行性疾病的癥狀[10]。何首烏乙醇提取物及二苯乙烯苷對百草枯和代森錳聯合誘導的PD小鼠模型、多巴胺能神經元和PC12細胞凋亡具有神經保護作用[11-13]。而EPM對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞的PD模型尚未見報道。

本研究發現EPM對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷有明顯的保護作用，可能是通過抗氧化應激來修復損傷的線粒體產生保護作用。細胞形態變化發現，模型組細胞胞體變小、軸突消失且出現小斑點，Hoechst33258染色后細胞核出現皺縮和大量的凋亡小體，表明MPP+能明顯誘導SH-SY5Y細胞凋亡，MTT法結果顯示0.5 mmol/L的MPP+作用48 h細胞存活率下降至對照組的44.7%； ROS和MDA水平分別是對照組的25.6倍和2.2倍；LDH泄漏率是對照組的1.8倍。EPM低、中、高劑量組能劑量依賴地提高細胞的存活率和降低細胞內MDA和LDH泄漏水平。

對照組模型組525100ρ(EPM)/(mg?L-1)ROS綠色熒光強度302520151050****

A.對照組； B.模型組； C.低劑量組； D.中劑量組； E.高劑量組。

與對照組、模型組比較：*P<0.01。

圖6EPM對MPP+損傷的SH-SY5Y細胞中ROS的影響

紅色/綠色熒光比1086420對照組模型組525100ρ(EPM)/(mg?L-1)****

A.對照組； B.模型組； C.低劑量組； D.中劑量組； E.高劑量組。

與對照組、模型組比較：*P<0.01。

圖7EPM對MPP+損傷的SH-SY5Y細胞線粒體膜電位的影響

在細胞凋亡過程中，線粒體功能失調，膜通透性增加，膜電位降低是細胞早期凋亡的一個標志[14]，而細胞凋亡也有可能與氧化應激有關，細胞內ROS急劇增加，導致線粒體膜電位改變、線粒體DNA及電子傳遞鏈損傷進而破壞線粒體功能，最終導致神經元變性死亡[15]。當MPP+在線粒體中累積，濃度不斷增高，抑制線粒體復合體I活性，導致ROS生成增加，當ROS在細胞內氧化水平超過了抗氧化作用時，氧化應激就會發生，其在神經退行性疾病的發生、發展中扮演了重要角色。本研究發現EPM低、中、高劑量組能夠顯著清除MPP+誘導的SH-SY5Y細胞內ROS水平。過多的ROS可以通過多種途徑損傷線粒體，造成線粒體膜電位下降。線粒體是細胞能量代謝的主要場所，線粒體復合體I活性降低使得線粒體呼吸鏈遭到破壞，導致ATP產生減少，最終導致細胞因能量耗竭而死亡，本實驗發現EPM低、中、高劑量組能劑量依賴地升高線粒體膜電位，修復線粒體功能。

以上結果提示，EPM對MPP+誘導SH-SY5Y損傷的細胞具有顯著的保護作用，并呈現劑量依賴性。其機制可能與其抗氧化應激、改善線粒體功能有關。EPM中含有29.5%的二苯乙烯苷，而其具有抗氧化和清除自由基等作用，所以二苯乙烯苷可能是其神經保護的主要化學物質基礎。c-Jun 氨基末端激酶(c-JunN-terminal Kinase,JNK)和Bcl-2家族蛋白與細胞凋亡關系密切，下一步將探討EPM對凋亡信號通路的影響。

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(責任編輯：幸建華)

Protective effect of extract ofPolygonummultiflorumon SH-SY5Y cells injured by MPP+

YANG Xu1,ZHAO Haizhou2,XU Dade2,LUO Zhanyuan1,ZHU Jing1,LIU Wenhua2,BEI Weijian1

(1.InstituteofChineseMedicinalSciences,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.SchoolofLifeScience,ZhaoqingUniversity,Zhaoqing526061,China)

Abstract:Objective To investigate the protective effect of extract of Polygonum multiflorum (EPM) on SH-SY5Y cells injured with MPP+. Methods SH-SY5Y cells were exposed to various doses of EPM for 4 h,and then treated with 0.5 mmol/L MPP+ for 48 h. The cell viability was detected with MTT assay,and cell morphology was observed with microscope and Hoechst 33258 staining. The level of malondialdehyde (MDA) and activity of lactate dehydrogenase (LDH) were measured with UV spectrophotometer. Reactive oxygen species (ROS) and the mitochondrial membrane potential were detected with fluorescence microscope. Results Compared with the control group,the viability of SH-SY5Y cells was decreased to 44.7% and the shrunk cell body and nuclear condensation were also observed in MPP+-treated group. Meantime,the activity of LDH,level of MDA and ROS were significantly increased,but the mitochondrial membrane potential was reduced. However,pretreatment with EPM (5,25 and 100 mg/L) prior to MPP+ administration rescued the cell viability,decreased the levels of LDH,MDA and ROS and restored mitochondrial membrane potential in SH-SY5Y cells. Conclusion EPM can protect the SH-SY5Y cells against the damage induced by MPP+,which may be involved in anti-oxidant activity.

Key words:extract of Polygonum multiflorum (EPM); SH-SY5Y cells; MPP+-induced cell injury; neuroprotective effect

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015120101

中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:A

文章編號:1006-8783(2016)01-0071-07

作者簡介：楊旭(1990—)，2013級碩士研究生，從事中藥活性成分研究與新藥研發，Email：398342273@qq.com；通信作者：貝偉劍，博士，研究員，碩士生導師，主要從事中藥藥理及新藥研發，Email: 764384278@qq.com；劉文華，博士，教授，碩士生導師，主要從事神經生物學研究，Email: wenhualiu@hotmail.com。

基金項目：國家自然科學基金項目(31271124)；廣東省重大專項(2013A022100041)；廣東省教育廳“創新強校”工程項目(2014KZDXM075)

收稿日期：2015-12-01

網絡出版時間：2016-01-22 15:31網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160122.1531.001.html