不同產地山藥中總多糖及尿囊素的含量分析

閆沛沛　楊文華　曹俊嶺　李朝峰　戚姝婭　趙華葉　樊冬鶴　張玉君　張夢捷

100029　北京中醫藥大學中藥學院[閆沛沛(碩士研究生)、楊文華(碩士研究生)、李朝峰(碩士研究生)、戚姝婭(碩士研究生)、趙華葉(碩士研究生)、樊冬鶴(碩士研究生)、張玉君(碩士研究生)、張夢捷(碩士研究生)]；北京中醫藥大學東直門醫院藥學部(曹俊嶺)；中國中醫科學院中藥資源中心(曹俊嶺)

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·論著·

不同產地山藥中總多糖及尿囊素的含量分析

閆沛沛楊文華曹俊嶺李朝峰戚姝婭趙華葉樊冬鶴張玉君張夢捷

100029北京中醫藥大學中藥學院[閆沛沛(碩士研究生)、楊文華(碩士研究生)、李朝峰(碩士研究生)、戚姝婭(碩士研究生)、趙華葉(碩士研究生)、樊冬鶴(碩士研究生)、張玉君(碩士研究生)、張夢捷(碩士研究生)]；北京中醫藥大學東直門醫院藥學部(曹俊嶺)；中國中醫科學院中藥資源中心(曹俊嶺)

【摘要】目的對比河南產地和河北產地山藥的品質，尋找優良品種。方法總多糖含量采用苯酚硫酸法測定；尿囊素含量采用高效液相色譜法測定，色譜條件：色譜柱：資生堂SPOLAR C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：乙腈-水(2：98)，流速：0.5 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長：224 nm。結果總多糖含量(%)河南產地山藥中為(14.65±1.43)%，河北產地山藥中為(7.78±2.83)%，二者有顯著性差異(P<0.01)；在尿囊素含量上二者沒有顯著性差異(P>0.05)。結論河南產地的山藥中含有較高的總多糖，可能藥用價值更高，品質更優，是值得關注的優良品種。

【關鍵詞】總多糖；尿囊素；河南產地山藥；河北產地山藥

山藥為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositeThunb.的根莖，《神農本草經》中將其列為上品，具有益氣養陰、養脾肺腎、固精止帶等功效?！渡褶r本草經輯注》[1]記載：“補虛羸，除寒熱邪氣，補中，益

氣力，長肌肉。久服耳目聰明，輕身、不饑，延年?！薄侗静萁浖ⅰ穂2]記載：“補虛勞羸瘦，充五臟，除煩熱，強陰?！爆F代研究表明山藥含有豐富的總多糖、淀粉、氨基酸、尿囊素等化學成分，具有抗腫瘤、降血脂、降血糖、提高免疫力等藥理作用。

目前，山藥的兩大主要產區為河南、河北，在進行市場調研時，發現河南產地的山藥外觀筆挺均勻類圓柱形，直徑2～3 cm，斷面緊致、顆粒感不明顯；而河北產地的山藥外觀扁圓柱形，有的一端分叉成手掌狀，直徑5～7 cm，須根蓬亂，斷面疏松、顆粒感明顯。本研究以河南、河北兩個產地的山藥為研究對象，對二者總多糖和尿囊素的含量進行差異性分析，為山藥的研究提供參考依據。

1儀器與材料

島津LC-20AT 型高效液相色譜儀(檢測器：SPDM20A)；KQ-300DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，300 W，40 kHz)；CPA2250型分析天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)；T6新世紀紫外可見分光光度儀(北京普析通用儀器有限責任公司)；SC-3610型低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)。

D-無水葡萄糖對照品(純度100.0%，批號：110833-200904)和尿囊素對照品(批號：111501-200202)均購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用；乙腈為色譜純(美國Fisher公司)；水為娃哈哈純凈水；苯酚、硫酸、乙醇均為分析純。

苯酚的純化方法：稱取苯酚100 g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.05 g，常壓蒸餾，棄初餾分，收集182℃餾分。精密稱取該餾分2.5 g至50 mL棕色容量瓶中，加純水溶解并定容至刻度，得5%苯酚，用錫箔紙密封避光，放入冰箱中備用。

表1　山藥樣品目錄

鐵棍山藥主要采自道地產區河南焦作，普通山藥為河南、河北種植的普通品種山藥，采藥時間為2014年11月～12月，經中國中醫科學院中藥研究所馮學鋒研究員鑒定為薯蕷科植物薯蕷的塊莖。見表1。

2方法

2.1山藥總多糖含量的測定方法

2.1.1對照品溶液的制備精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品約5 mg，置50 mL容量瓶中，加水溶解，定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液備用。

2.1.2供試品溶液的制備精密稱取山藥粉末約1.5 g置100 mL三角錐形瓶中，加入50 mL純水，于80℃水浴中回流提取2小時，放至室溫補重，于3000 rmp下離心15分鐘，精密量取1 mL置100 mL容量瓶中，定容，備用。

2.1.3標準曲線分別精密量取對照品溶液各0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置10 mL具塞試管中，各加水至1.0 mL，精密加入新配置的5%苯酚溶液1.0 mL和濃硫酸5.0 mL，搖勻，放置10分鐘后30℃水浴20分鐘，取出，搖勻。室溫下按照紫外分光光度法，在490 nm波長處測定吸光度，以吸光度為橫坐標(X)，濃度為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，回歸方程為：Y=0.0869X+0.0003，r=0.9994，線性范圍為0.00～0.11 mg/mL。

2.1.4方法學考察(1)精密度試驗：取3號樣品約1.5g，精密稱定，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，“2.1.3”項下方法連續測定6次，計算總多糖質量分數，RSD為1.21%，表明該儀器精密度良好。(2)重復性試驗：精密稱取同一樣品6份，每份約1.5 g，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，“2.1.3”項下方法測定并計算總多糖質量分數，RSD為0.37%，表明重復性良好。(3)穩定性試驗：精密稱取同一供試品溶液，分別于5、10、20、30、40、50、60、80分鐘測定吸光度，計算總多糖質量分數，RSD為0.41%，表明供試品溶液在80分鐘內穩定。(4)加樣回收率試驗：采用加樣回收法。精密稱取3號樣品(已知含量為13.47%)6份，每份約0.75 g，分別精密加入無水葡萄糖對照品適量，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，“2.1.3”項下方法測定，計算含量和回收率，結果如表2。

表2　回收率實驗

2.2尿囊素含量的測定方法

2.2.1色譜條件色譜柱：資生堂SPOLAR C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(2∶98)；流速：0.5 mL/min，柱溫：25℃，檢測波長：224 nm，進樣量：10 μL。見圖1。

A.對照品；B.樣品；1.尿囊素

2.2.2對照品溶液的制備精密稱取尿囊素對照品適量至25 mL容量瓶中，加入20%乙醇溶解，定容至刻度，即得。

2.2.3供試品溶液的制備取樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入20%乙醇25 mL，稱重，超聲45分鐘，放置至室溫，稱重，用20%乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾，棄初濾液，取續濾液，過微孔濾膜(0.22 μm)即得。

2.2.4標準曲線精密稱取尿囊素對照品約13.65 mg，置25 mL容量瓶中，用20%乙醇定容至刻度，搖勻。依次進行等度稀釋，得0.0023、0.0046、0.0092、0.019、0.037、0.073、0.15、0.21、0.26 mg/mL的對照品溶液，進樣10 μL，測定峰面積，以質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)制作標準曲線，回歸方程為Y=5.81×106X-2.42×103，r=0.9999，線性范圍為0.00057～0.26 mg/mL。

2.2.5方法學考察(1)精密度試驗：取4號樣品粉末約0.5g，精密稱定，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，連續進樣6次，計算尿囊素質量分數，RSD為0.17%，表明該儀器精密度良好。(2)重復性試驗：精密稱取同一樣品6份，每份約0.50 g，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，測定并計算尿囊素質量分數，RSD為1.06%，表明重復性良好。(3)穩定性試驗：精密稱取同一供試品溶液，分別于0、1、2、3、4、8、10、12小時進樣，測定并計算尿囊素質量分數，RSD為1.14%，表明該樣品在12小時內穩定。(4)加樣回收試驗：精密稱取4號樣品(尿囊素含量為1.04%)粉末6份，每份約0.25 g，加入尿囊素對照品適量，測定含量并計算回收率，結果見表3。

表3　尿囊素回收率實驗

3結果

3.1總多糖含量測定結果

精密稱取各個樣品粉末約1.5 g，分別按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，“2.1.3”項下方法測定總多糖含量；按照水分測定法[3](第二法)測定山藥樣品的水分含量；計算山藥樣品的干燥品總多糖含量，采用SPSS 17.0對測定數據進行統計分析，結果見表4和表5。從表4可以看出，河南產地山藥中的總多糖含量明顯比河北產地的總多糖含量高，二者有顯著差異(P<0.01)。

表4　總多糖含量測定結果

表5　總多糖結果統計分析

注：aP<0.01。

3.2樣品尿囊素含量測定結果

精密稱取各個山藥樣品約0.5 g，按照“2.2.3”項下制備供試品溶液，“2.2.4”項下測定并計算尿囊素含量；對所得數據進行統計學分析，結果見表6和表7。

表6　尿囊素含量測定結果

表7　尿囊素結果統計分析

注：P>0.05

4討論

山藥總多糖可以調節人體免疫系統，提高免疫力[4]；有顯著的抗疲勞[5]和降低血糖等作用[6]；還有清除自由基、抗氧化作用，其抗氧化性隨總多糖濃度的增加而增強，呈明顯的劑量依賴性[7-9]；總多糖鐵復合物可以較好地治療缺鐵性貧血[10]；從山藥總多糖中分離得到的RDPS-1在一定濃度時對Lewis肺癌和B16黑色素瘤有顯著的抑制效果[11]。何新蕾等[12]還發現鐵棍山藥總多糖對CCl4所誘導的小鼠肝損傷有一定的保護作用。尿囊素是山藥的活性成分之一，具有抗刺激、麻醉鎮痛、消炎抑菌等作用，常用于治療手足皸裂、魚鱗病、多種角化皮膚病等[13]。由此可以看出，總多糖可能是山藥產生補益等作用的主要活性成分。

本研究參照文獻[14]，對HPLC色譜條件進行了優化，比較了流動相比例(10∶90、 5∶95、 2∶98、1∶99)、柱溫(25℃、30℃、35℃)、流速(1.0、0.8、0.5、0.4、0.2 mL/min)等條件，按照色譜條件：流動相：乙腈-水(2∶98)，流速：0.5 mL/min，柱溫：25℃，檢測波長：224 nm，進樣量：10 μL測定時，基線穩定，出峰時間適當，分離效果好，確定此條件為HPLC測定條件。

對河南產地和河北產地的不同批次山藥樣品中總多糖和尿囊素的含量進行統計學分析，發現河南產地山藥中的總多糖含量(%)為(14.65±1.43)，河北產地中為(7.78±2.83),P<0.01；河南產地和河北產地的山藥中尿囊素含量沒有顯著性差異。由結果可知，河南產地的山藥中含有較高的山藥總多糖。多糖類成分具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、提高免疫力等作用，與山藥的臨床藥理作用相符，提示河南產地的山藥可能具有更高的藥用價值；同時，多糖類成分可以作為評價山藥品質的重要指標性成分之一。

懷山藥的優良品種鐵棍山藥，是山藥中的“珍品”，而本次研究所選取的山藥即為鐵棍山藥，因此，實驗具有一定的研究意義。

參考文獻

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(本文編輯： 董歷華)

Content analysis of polysaccharide and allantoin ofDioscoreaoppositeThunb. from different habitats

YANPei-pei，YANGWen-hua，CAOJun-ling，etal.BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

【Abstract】ObjectiveTo compare the quality of the Dioscorea opposite Thunb. from Henan and Hebei by determining the content of polysaccharide and allantoin. MethodsPhenol-sulfuric acid method was used to determine the content of polysaccharide. Allantoin content was determined by high performance liquid chromatography. SPOLAR C18(250mm×4.6mm,5μm) was used. Mobile phase was acetonitrile-water (2：98). The flow rate was 0.5 mL/min. The column temperature was set at 25℃.The detection wavelength was set at 224 nm. ResultsThe polysaccharide content(%) in the Dioscorea opposite Thunb. from Henan was (14.65±1.43), while the Hebei was (7.78±2.83). There was significant statistical difference between the two varieties(P<0.01). There was no significant difference of the allantoin content between the varieties(P>0.05). ConclusionThe Dioscorea opposite Thunb. from Henan contains higher polysaccharide, which might have higher medicinal value and better quality, deserves paying close attention as a good variety.

【Key words】Polysaccharide；Allantoin；Dioscorea opposite Thunb. from Henan；Dioscorea opposite Thunb. from Hebei

(收稿日期：2015-12-19)

Corresponding author：CAO Jun-ling，E-mail：caojunling72@163.com

【中圖分類號】R284

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.03.010

作者簡介：閆沛沛(1989- )，女，2013級在讀碩士研究生。研究方向：中藥材山藥等級規格標準的研究。E-mail：yanpeifighting@163.com通訊作者： 曹俊嶺(1972- )，博士，主任藥師。研究方向：臨床安全合理用藥。E-mail：caojunling72@163.com

基金項目：中央本級重大增減支項目(2060302)；國家自然科學基金(81130070)；江蘇高校協同創新項目