甘草酸促進雌二醇分泌拮抗去卵巢大鼠骨質疏松的影響研究

陳秋生， 林春燕， 嚴文健， 劉鈺瑜， 許衛銘

(廣東醫學院生理科學實驗室a，藥理學教研室b， 廣東 湛江 524023)

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甘草酸促進雌二醇分泌拮抗去卵巢大鼠骨質疏松的影響研究

陳秋生a， 林春燕a， 嚴文健b， 劉鈺瑜b， 許衛銘b

(廣東醫學院生理科學實驗室a，藥理學教研室b， 廣東 湛江 524023)

【摘 要】目的:觀察甘草酸對去卵巢骨質疏松(ovariectomized，OVX)大鼠骨代謝的影響。方法:將50只2月齡雌性SD大鼠隨機分為五組，第1組(假手術)和第2組(OVX)接受10mL生理鹽水的灌胃治療，第3組(OVX)，第4組(OVX)和第5組(OVX)分別接受低劑量0.05kg/ d，中劑量0.1kg/ d和大劑量0.2kg/ d甘草酸的灌胃治療。8周后測定大鼠子宮重量，尿液及血液鈣的含量，左側股骨及腰椎L4的礦物質含量以及血液中堿性磷酸酶(ALP)和雌二醇的含量。結果:與OVX組相比，中、高劑量組甘草酸可有效減少血清和尿液中鈣的排泄，提高血清中堿性磷酸酶的量，增加了股骨和腰椎部位骨礦物含量。同時大鼠子宮重量以及血清當中雌二醇的含量也表現出明顯的增加結論:甘草酸可能通過促進雌二醇的分泌減少骨的重吸收進而拮抗大鼠骨質疏松。

【關鍵詞】甘草酸； 去卵巢大鼠； 破骨細胞； 雌二醇； 骨質疏松

甘草中的甘草酸(Glycyrrhizic Acid，GA)具有護肝、抗病毒、抗炎癥、參與免疫調節、輔助促進吸收等作用[1]。我們課題組前期的研究表明，甘草提取物甘草酸聯合雌激素具有較好的防治骨質疏松癥的作用[2，3]。本實驗研究甘草酸對去卵巢大鼠骨代謝的影響和其對雌激素分泌的調節作用之間的關系，為甘草酸用于骨質疏松的治療提供初步理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料:50只SD雌性大鼠，2月齡，體重200g± 10g，由廣東醫學院實驗動物中心提供。甘草酸:甘草5 kg，三次水提液過濾濃縮至12 kg(體積12L)，加濃硫酸48ml，靜置，收集沉淀，沉淀用水洗至中性，再用95%乙醇回餾提取3次，過濾提取液，回收乙醇。沉淀(黏稠)，用水洗液調節PH=3，收集沉淀，干燥，得甘草酸106g，用生理鹽水配成1%的母液備用[4]。(主要儀器有自動化圖像數字化分析儀包括光鏡和熒光顯微鏡(Nikon，日本)，采用骨組織形態計量學測量軟件(KSS Scientific Consultants，USA)觀察分析。

1.2 方 法

1.2.1 手術:腹腔注射麻醉，10%水合氯醛，劑量為0. 3mL/100g大鼠。大鼠俯臥位固定于手術臺上，距肋后緣下1.5cm、后正中線旁1.5cm處取長約1cm雙背側縱行切口，依次切開，進入腹腔，用平鑷將卵巢牽出，在輸卵管與子宮角交界處結扎，摘除卵巢。假手術組只切開不摘除卵巢。最后沖洗傷口，止血，縫合關閉傷口。術后給予大鼠肌肉注射青霉素鈉20萬單位，連續3d，預防感染。第1組(假手術)和第2組(OVX)經口接受5mL生理鹽水治療，第3組、第4組和第5組分別經口接受0.05g·kg-1·d-1、0.1g·kg-1·d-1和0.2g·kg-1·d-1甘草酸治療。灌胃量按照5mL/大鼠的量進行。時間為8周，每周記錄動物體重，治療最后一天取動物子宮稱重，同時計算子宮相對重量即每100g大鼠子宮的重量[4，5]。

1.2.2 尿液和血清中鈣的測定:治療前最后1d人工誘導大鼠排尿，收集后-20℃保存。麻醉后大鼠背部主動脈采集血液，血液用預先含有枸櫞酸鈉烤干的試管進行收集，-20℃保存。尿液采用蒸餾水進行適當的稀釋后，通過火焰光度法(EHSY，China)測定尿中的鈣含量。血液采用偶氮胂-3染料和鉬酸銨比色法分析血清樣品中鈣的含量[6]。

1.2.3 骨礦物質鈣含量的測定:將左側股骨和L-4椎體在620℃下礦化48h并稱重。將礦化的骨溶于6 M HCl中，然后加過量的硫酸鈉，沉淀完全后過濾干燥測硫酸鈣的質量用作反映股骨中鈣含量[7]。

1.2.4 血清中雌二醇和堿性磷酸酶的測定:采用直接放射免疫試劑盒(Asbio Technology，Inc，China聚研生物科技有限公司)分析血清雌二醇。通過堿性磷酸酶試劑盒(上海酶聯生物技術公司)測定血清中堿性磷酸酶(ALP)的活性。

1.2.5 骨組織形態學分析:取左側脛骨，用低速鋸暴露骨髓腔，進行固定、脫水、包埋，制成5μm切片，采用Masson-Goldner Trichrome染色，染色步驟為①切片二甲苯脫蠟，乙醇漂洗，入水。②入配制好的Weigert鐵蘇木素染色。③流水沖洗1min，用酸性分化液迅速分化(一般<5s)。④流水沖洗，蒸餾水稍洗。⑤入Acid Ponceau染色液染色。⑥在上述過程中按蒸餾水:弱酸溶液= 4:1比例配制弱酸工作液，用弱酸工作液洗。⑦入Orange G染色液染色，直至Ponceau染色液。⑧用配制好的弱酸工作液沖洗。⑨直接入亮綠染色液中染色，用配制好的弱酸工作液沖洗3次。⑩蒸餾水沖洗，吸干或晾干，無水乙醇快速脫水，中性樹膠封固。染色后，骨質為綠色，骨髓為紅色用于觀察骨形態。

1.3 統計學方法:采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示。組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 甘草酸對去卵巢大鼠子宮重量和體重的影響: OVX大鼠的絕對和相對子宮重量顯著低于假手術大鼠。而中、高劑量組甘草酸治療后大鼠的子宮重量較OVX組顯著增加(P< 0.05)。子宮萎縮狀態得到一定緩解。而低劑量甘草酸治療組沒有顯示出萎縮子宮重量的顯著增加(表1)。

表1 甘草酸對去卵巢大鼠子宮重量的影響(n=10)

表2 甘草酸對去卵巢大鼠血清和尿液中鈣的影響(n=10)

2.2 去卵巢大鼠血清和尿液中鈣濃度的檢測:OVX對照組的尿鈣排泄顯著增加，而各劑量組甘草酸均能減少尿中Ca2+排泄，血清中Ca2+的檢測也表明OVX對照組Ca2+的濃度有所下降，而中高劑量甘草酸治療組能明顯提高血中Ca2+的濃度，差異具有統計學意義，結果見表2。

2.3 骨組織形態學觀察和骨礦物質含量的檢測:對股骨干骺端組織切片進行鏡下觀察可見，OVX組海綿骨骨量，骨小梁厚度，明顯低于假手術組，骨小梁間距則明顯寬于假手術組。而甘草酸治療組可緩解上述由去卵巢帶來的骨形態學改變，與OVX組相比，骨小梁間距縮窄，骨小梁厚度增厚，海綿骨骨量增加。(圖1)與OVX組相比，給予去卵巢大鼠甘草酸治療后可使骨骼中骨礦物質鈣的含量呈劑量依賴性的升高，其中最高劑量組大鼠的股骨及L-4椎體的骨礦物質含量分別增加了30.26%和45.14% (P< 0.05)(表3)。

圖1 大鼠股骨干骺端不脫鈣組織形態學觀察圖。A.假手術組；B. OVX組；C.低劑量甘草酸治療組；D.中劑量甘草酸治療組；E.高劑量甘草酸治療組。Masson-Goldner Trichrome染色(× 10倍)

表3 甘草酸對去卵巢大鼠骨鈣含量的影響(n=10)

2.4 血清堿性磷酸酶(ALP)和雌二醇的檢測:結果顯示，OVX組大鼠的血清雌二醇水平和堿性磷酸酶的水平較假手術組顯著降低。而經過甘草酸的治療后，與OVX組相比，中劑量和高劑量甘草酸治療組會導致雌二醇水平的表達顯著增高，分別增高了50.58%和59. 53% (P< 0.05)，而堿性磷酸酶的表達也同時增高了20.3%和55.3% (P< 0.05) (表4)。

表4 甘草酸對去卵巢大鼠血清堿性磷酸酶和雌二醇的影響(n=10)

3 討 論

絕經后婦女由于受到體內雌激素水平下降及衰老雙重影響，成為骨質疏松疾病的最大受害人群，占總發病人群的70%以上。雌激素能防治絕經后骨礦物質進行性丟失，減少骨質疏松性骨折的發生率。但是，長期使用雌激素也可能帶來其他系統的不良反應，主要是增加罹患乳腺癌和子宮內膜癌等生殖系統腫瘤的危險性。因此，目前臨床上已經很少再選擇雌激素替代療法來治療絕經后骨質疏松癥。但是雌激素能延緩絕經后婦女骨質疏松的發生發展是不爭的事實[5~7]。

我國傳統中醫藥材中甘草提取物甘草酸和甘草甜素等屬于安全無毒物質。甘草酸幾乎沒有毒副作用，且被發現具有促進成骨細胞的生長和增強其分泌功能，影響骨組織中的微量元素而起對抗肝纖維化引起的骨丟失的作用，但是機制尚不明確。在本研究中，通過去卵巢大鼠在體觀察，我們發現甘草酸明顯增加了大鼠的體重，骨礦物質的沉淀，提高了血清堿性磷酸酶的表達，減少了鈣的排泄。成骨細胞早期發育階段特異性標志物就是堿性磷酸酶，它可抑制骨礦化過程中的無機焦磷酸鹽向無機磷水解，在細胞外基質礦化中起關鍵作用。堿性磷酸酶的活性高低可反映成骨細胞的成熟狀態。實驗結果顯示骨礦物質含量的改變趨勢與堿性磷酸酶保持一致，而股骨組織形態學的檢測也發現甘草酸可以緩解因去卵巢帶來的骨質疏松的改變，例如骨小梁厚度降低，骨小梁間距變寬以及海綿骨骨量減少等。以上結果說明甘草酸在一定程度延緩了去卵巢大鼠的骨質疏松的進程。

與此同時，我們的研究也發現，甘草酸還可以對去卵巢大鼠子宮的萎縮具有一定的拮抗能力，而且能夠顯著提高血清雌二醇含量，目前已知雌激素可以促進成骨細胞表達堿性磷酸酶、增加膠原的合成和刺激成骨細胞分泌骨鈣素，還可上調成骨細胞的骨保護蛋白mRNA的表達[8]。對骨髓基質干細胞的分化也有調節作用，可促使干細胞向成骨細胞方向分化。這些作用可能是甘草酸發揮其防治骨質疏松的機制之一。

上述結果表明，提高堿性磷酸酶以及雌二醇含量可能是甘草酸拮抗骨質疏松的機制之一，研究結果為甘草酸用于絕經后骨質疏松患者的治療提供初步實驗依據。

【參考文獻】

[1] Cui L，Wu T，Liu XQ，et al. Prevention effects of gensenosides on osteopenia of rat induced by ovariectomy[J].Acta Pharmacologica Sinica，2001；22:428~434.

[2] 武密山，趙素芝，任立中，等.川續斷皂苷Ⅵ誘導大鼠骨髓間充質干細胞向成骨細胞方向分化的研究[J].中國藥理學通報，2012，28(2):222~226.

[3] 曾曉東，歐定強，劉月紅，等.雌激素聯合甘草酸對去卵巢小鼠骨代謝及生物力學指標的影響[J].山東醫藥，2011， 51(47):9~11.

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臨床研究

Glycyrrhizic Acid Promote the Secretion of Estradiol Antagonism to Ovary Osteoporosis of Rats

CHEN Qiusheng， LIN Chunyan， YAN Wenjiang， et al
(Guangdong Medical College，Guangdong Zhanjiang 524023，China)

Abstract:Objective: To observe the effect of glycyrrhizic acid on bone metabolism of ovariectomized rat. Method: Female rats were randomly divided into five groups: sham operation group (Sham)，ovariectomized group (OVX). Group 1 (sham operation) and Group 2 (OVX) were treated by 10ml NS/ d，Group 3~5 were treated with glycyrrhizic acid from 0.05mg·kg-1·d-1to 0.2mg·kg-1·d-1. Urinary calcium，serum calcium and ALP and estradiol were examined.Result: Compared with the pure saline treatment of OVX group，middle and high dose group of glycyrrhizic acid can effectively reduce the excretion of calcium in the blood and urine，reduced the expression of ALP in the blood，increased femur and lumbar spine bone mineral content. At the same time the rat uterus weight and blood estradiol levels also showed obvious increase. Conclusion: Glycyrrhizic acid can promote the secretion of estradiol and decrease bone reabsorption and antagonism of osteoporosis..

【Key words】Glycyrrhizic acid； Ovaries rats； Osteoclast； Estradiol； Osteoporosis

【基金項目】廣東省湛江市科技攻關項目，(編號:2012C3106021)；廣東省大學生創新創業訓練計劃項目，(編號:1057112016)通訊作者:許衛銘

【文章編號】1006-6233(2016)03-0474-04

【文獻標識碼】B 【doi】10.3969/ j.issn.1006-6233.2016.03.043