復合菌肥與化肥配施對高寒地區土壤微生物數量和土壤酶活性的影響

陳娟麗，師尚禮，祁　娟

(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業

可持續發展研究中心，甘肅 蘭州　730070)

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復合菌肥與化肥配施對高寒地區土壤微生物數量和土壤酶活性的影響

陳娟麗，師尚禮，祁娟

(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業

可持續發展研究中心，甘肅 蘭州730070)

摘要：以種植第3年的金皇后紫花苜蓿為材料，以不施肥為對照，研究了固氮菌肥、磷肥、混合菌肥及磷肥與混合菌肥不同比例配施對高寒區土壤微生物數量和土壤酶活性的影響。結果表明：不同比例配施處理后，0～10、10～20 cm土層中土壤微生物(細菌、放線菌、真菌)總數、脲酶、蔗糖酶、蛋白酶活性均增加。土壤3大類微生物數量均表現為細菌>放線菌>真菌。0～10 cm土層中的微生物數量均高于10～20 cm土層中的數量。不同比例的磷肥與混合菌肥配施后的細菌、放線菌數量高于單施磷肥或混合菌肥后的數量，配施后各土層的細菌數量與對照和單施磷肥或混合菌肥后的數量之間有著顯著差異。施加50%磷肥+混合菌肥后細菌、真菌數量最多。0～10 cm土層中的脲酶、蔗糖酶、堿性磷酸酶和蛋白酶高于10～20 cm土層中的酶活力，但10～20 cm土層中的過氧化氫酶活力高于0～10 cm土層中的酶活力。不同比例的磷肥與混合菌肥配施后的脲酶活力高于單施磷肥或混合菌肥后的酶活力。相關性研究表明，施肥后各土層土壤微生物與土壤酶之間存在不同程度的相關性。

關鍵詞：紫花苜蓿；微生物菌肥；土壤微生物；土壤酶

王格爾塘鎮位于甘肅省甘南州夏河縣，屬于半農半牧區。由于氣候干旱加之土壤貧瘠，飼草料嚴重缺乏[1]。最受家畜喜食且被稱為“牧草之王”的苜蓿，雖有好的適口性和高的營養價值，但因受到環境條件的限制，未能滿足家畜的需求[2]。為獲得優質高產的苜蓿，施肥成了重要的手段和方法。隨著對化學肥料的日益依賴，出現土地板結、土壤養分比例失調和質量下降等問題[3]。因此，尋找能替代或部分替代化肥的新肥源(尤其是生物菌肥)倍受關注[4]，生物菌肥能增加土壤肥力，并能改善植物環境[5]。經過長期的試驗探究發現，單施生物菌肥不能滿足植物生長的需要，特別是在土壤貧瘠的地方，其增產效果有限，若與其他肥料配施，效果顯著[6,7]。有關微生物肥料,目前，在農作物如玉米、水稻和燕麥等及蘋果、草莓等蔬菜水果產量方面研究較多[8-11]，但有關菌種互作對紫花苜蓿品質影響研究尚不多見[12]。

降水量、溫度、施肥等很多因素均會對微生物產生一定的影響。土壤微生物的種類、數量及其分布對土壤的變化具有高度敏感性，因此，被用作土壤生物活性最敏感的指標之一。某種特定的土壤酶的活性不能用于土壤肥力的總體評價內容，但結合其他因素(如土壤微生物)，可反映土壤的肥力狀況[13]。

在甘南州夏河縣王格爾塘鎮以種植第3年的金皇后紫花苜蓿為試驗材料，通過不同比例的化肥與混合菌肥配施后，進行土壤微生物和土壤酶分析，尋找化肥與混合菌肥之間的最優配施方式，為高寒區合理使用肥料、培育優質牧草提供科學依據。

1材料和方法

1.1研究區概況

試驗在甘南州夏河王格爾塘鎮進行，海拔2 500 m，平均氣溫4℃，最高氣溫28.9℃，最低氣溫-24.6℃。屬寒冷濕潤類型,高原大陸性氣候特點比較明顯，年降水量516 mm，全年無霜期56 d，年日照2 296 h≥0℃活動積溫2 300℃，≥10℃的積溫215～1 636℃，年日照數2 500 h，年降水量450 mm，絕對無霜期40 d，年均蒸發量1 200～1 350 mm，土壤為石灰性草甸土。

1.2試驗設計

2011年6月底種植金皇后紫花苜蓿，播種量為22.5 kg/hm2，苜蓿返青前施肥，小區面積4 m×6 m，磷酸二銨(150 kg/hm2)、農家肥為底肥。試驗的肥料種類有固氮菌肥、磷肥和混合菌肥，設7個處理：(1)不施肥(CK)；(2)固氮菌肥(22.5 kg/hm2)(N)；(3)磷肥(1 200 kg/hm2)(P)；(4)混合菌肥(22.5 kg/hm2)(M)；(5)75%磷肥(900 kg/hm2)+混合菌肥(22.5 kg/hm2)(75%P+M)；(6)50%磷肥(600 kg/hm2)+混合菌肥(22.5 kg/hm2)(50%P+M)；(7)25%磷肥(300 kg/ hm2)+混合菌肥(22.5 kg/hm2)(25%P+M)。混合菌肥采用微生物促生菌(溶磷菌+固氮菌)，供試菌肥由甘肅農業大學草業學院微生物實驗室提供，菌株經液體擴大培養，泥炭吸附后菌肥含活性菌≥2×108 cfu/g，用一定量的土拌勻利于田間撒施均勻。所有肥料混合均勻、開溝條施于行間，深度是3～5 cm。試驗為完全隨機區組設計，重復3次。

1.3土壤樣品的采集

2013年6月，土層(0～10 cm)和(10～20 cm)用土鉆法采集土樣。把采集的土樣分成兩部分裝入無菌袋中，一部分鮮土帶回實驗室放入4 ℃冰箱進行微生物培養；另一部分土樣自然風干后過篩，用于土壤酶活性測定。

1.4指標測定

土壤微生物采用稀釋平板計數法，細菌用牛肉膏蛋白胨培養基測定，真菌用馬丁氏培養基測定，放線菌用改良高氏1號培養基測定[14,15]。過氧化氫酶用高錳酸鉀滴定測定，脲酶用苯酚鈉—次氯酸鈉顯色法測定，磷酸酶用磷酸苯二鈉比色法測定，蔗糖酶用3,5-二硝基水楊酸比色法測定，蛋白酶用茚三酮比色法測定[16,17]。所有指標測定均重復3次。

1.5數據統計分析

Microsoft Excel處理數據并制圖，SPSS軟件進行方差分析、多重比較。

2結果與分析

2.1不同施肥處理對土壤微生物數量的影響

無論土壤中是否施肥，土壤中3大類微生物數量均表現為細菌數量最多，放線菌次之，真菌最少。0～10 cm土層中細菌數量、微生物總數明顯多于10～20 cm土層中的數量。土壤微生物中細菌所占份額最大，為59%～84%，放線菌所占比例為16%～41%，真菌數量在微生物總數中的比例在0.1%以下，所以，土壤微生物總數中真菌數量可近似忽略(表1)。

施肥使土壤中細菌數量明顯增多。單施P，M和N后，細菌數量差異不顯著。P與M配施時，在施加等量M的基礎上，配施50%P后，細菌數量最多。P與M配施后細菌數量高于單施P或M后的數量。在0～10 cm土層，各種施肥處理與對照CK(不施肥)差異顯著(P<0.05)。施加50%P+M后，細菌數量最多，是對照的3.44倍，與對照或其他施肥處理后的數量之間存在顯著差異。在10～20 cm土層，施肥后細菌數量增加了34.7%～259.0%。

施肥后，土壤中放線菌數量增加。施加25%P+M后，土壤中放線菌數量最多。與對照相比，施加P或M，放線菌數量差異不顯著。P與M配施后放線菌數量顯著多于單施P或M后的數量。在0～10 cm土層，施肥后土壤中的放線菌增加了6.45%～66.2%。在10～20 cm的土層中，施肥后放線菌數量增加了24.7%～200.0%。施加25%P+M，土壤中的放線菌數量是對照的3.57倍，與對照和單施P，M或N后的放線菌數量有著顯著差異。

施肥對土壤中真菌數量影響較大，不同土層真菌數量變化不同。施肥后土壤中真菌數量均增加。在0～10 cm土層，施加50%P+M后，土壤中的真菌數量最多，是對照的3倍，與對照和單施P后的數量有著顯著差異。施加P、M和25%P+M后，與對照相比，土壤中真菌數量差異不顯著。施加75%P+M和50%P+M后的真菌數量多于單施P或M后的數量。在10～20 cm的土層，單施N后，土壤中的真菌數量最多，是對照的3.57倍，與對照和其他施肥處理后的真菌數量差異顯著。與對照相比，施加P，M或P與M配施后，土壤中真菌數量差異不顯著，但高于單施P或M后的數量。

對施肥后的土壤細菌、放線菌、真菌的數量進行測定，進而累加得到土壤微生物總數(細菌、放線菌、真菌數量之和)。施肥后微生物總數均增加，不同比例的P與M配施后，微生物總數顯著多于單施P或M后的數量。施加50%P+M后，土壤中微生物總數量值最多。在0～10 cm土層中，微生物總數從高到低依次為施加50%P+M(15.21×105)>25%P+M(13.78×105)>75%P+M(12.04×105)>N(7.67×105)>M(7.02×105)>P(6.65×105)>CK(5.10×105)。施加50%P+M后，土壤中微生物總數是對照的2.98倍。在10～20cm土層中，微生物總數自高到低依次為施加50%P+M(12.86×105)>25%P+M(11.06×105)>75%P+M(9.78×105)>M(5.85×105)>N(5.75×105)>P(5.74×105)>CK(3.81×105)。施加50%P+M后，土壤中微生物總數量值最大，是對照的3.38倍。

表1　不同施肥處理下土壤微生物數量

注：同列不同小寫字母表示不同施肥處理差異顯著(P<0.05)

2.2不同施肥處理對土壤酶活性的影響

2.2.1不同施肥處理對土壤過氧化氫酶活性的影響生物呼吸和有機物的氧分解均會產生過氧化氫，無論對于土壤還是生物，它都會產生毒害作用。但土壤存在過氧化氫酶，可通過酶促反應將過氧化氫分解，生成水和氧氣，以此來減輕或徹底解除過氧化氫對生物或土壤的毒害作用。圖1表明，10～20 cm土層中過氧化氫酶活力高于0～10 cm土層中的酶活力。在0～10 cm土層中，施肥后過氧化氫酶活力均高于對照，但沒有顯著差異。施加N后，過氧化氫酶活力最高，為0.915 mL/g。單施N，P或M后的過氧化氫酶活力高于P與M配施后的酶活力。在10～20 cm土層中，施肥并未使土壤中過氧化氫酶活力均增加。施加P后，過氧化氫酶活性最高為0.918 mL/g。各施肥處理后的過氧化氫酶活力及與對照間的酶活力差異不顯著(圖1)。

圖1　不同施肥處理下土壤過氧化氫酶活性Fig.1　Effect of soil hydrogen peroxidase activity under different treatments

2.2.2不同施肥處理對土壤脲酶活性的影響土壤中施加的尿素只能在土壤脲酶的作用下分解生成水、二氧化碳和氨，氨是植物氮源的來源之一。由此，土壤脲酶的活性和土壤的供氮能力有著密切的關系。不同施肥處理后脲酶活力增加，0～10 cm土層中脲酶活力高于10～20 cm土層中的酶活力。P與M配施后的脲酶活力高于單施P或M時的酶活力,施加50%P+M后的脲酶活力低于施加25%P+M和75%P+M后的酶活力(圖2)。在0～10 cm土層中，施加25%P+M后，土壤脲酶活力最高，為0.722 mg/g，比對照高出16.75%，且與對照有著顯著差異。施加N和75%P+M后，土壤中脲酶活力增加，與對照之間差異顯著。施加P，M和50%P+M后，土壤中脲酶活力略有增加，但與對照的差異不顯著。在10～20 cm土層中，施肥后脲酶活力有所增加，各處理間差異不顯著。

圖2　不同施肥處理下土壤脲酶活性Fig.2　Effect of soil urease activity under different treatments

2.2.3不同施肥處理對土壤磷酸酶活性的影響磷酸酶是對有機磷的催化作用具有專一性特點的蛋白質，可以加快有機磷的脫磷速度，從而提高了土壤中磷元素的有效性。土壤中的磷酸酶包括酸性磷酸酶、中性磷酸酶和堿性磷酸酶。有研究報道，在測定土壤磷酸酶的生物活性時，可將3種磷酸酶中活性比例最大的一種酶算作是磷酸酶活性，其余2種磷酸酶活性可忽略。試驗地土壤為堿性，因此，測定土壤中的磷酸酶時只測定了堿性磷酸酶活性。0～10 cm土層的磷酸酶活力高于10～20 cm土層。施加P后土壤中的磷酸酶活力最高,在0～10 cm土層中為0.965 mg/g。施加N(0.859 mg/g)和M(0.851 mg/g)后的磷酸酶活力低于對照，但與對照之間沒有顯著差異。P與M配施后，磷酸酶活力高于對照和單施M，但低于單施P時的酶活力。單施N或M與單施P或75%P+M有顯著差異(P<0.05)。不同比例的P和M配施時，在施加等量M的基礎上，隨著配施P的量逐漸減少，土壤中的堿性磷酸酶活力降低(圖3)。

圖3　不同施肥處理下土壤磷酸酶活性Fig.3　Effect of soil phosphatase activity under different treatments

2.2.4不同施肥處理對土壤蔗糖酶活性的影響蔗糖酶可將土壤中大分子量的糖分解，進而生成易被植物或微生物吸收利用的果糖和葡萄糖。它的活性可以反映有機物質積累和轉化的規律，而且與環境中CO2氣體的排放有著密切關系，是促進土壤碳素循環的重要環節部分。與對照相比，不同的施肥處理后，土壤中蔗糖酶活力增加，但增加程度較小，0～10 cm土層中蔗糖酶活力高于10～20 cm土層(圖4)。在0～10 cm土層中，施肥后，蔗糖酶活力增加，但各處理之間沒有顯著差異。施加M后，土壤中的蔗糖酶活力最高為35.78 mg/g。不同比例的P與M配施后的蔗糖酶活力高于單施P后的酶活力(34.98 mg/g)，但低于單施M時的酶活力(35.78 mg/g)。在10～20 cm土層中，施加25%P+M后的蔗糖酶活力最高為35.38 mg/g，與對照有著顯著差異。不同比例的P與M配施后的蔗糖酶活力高于單施磷肥時的酶活力。施加75%P+M或25%P+M后的蔗糖酶活力與對照差異顯著(P<0.05)，但這2種處理后的土壤蔗糖酶活力之間沒有顯著差異。

2.2.5不同施肥處理對土壤蛋白酶活性的影響蛋白酶可以將肽類和蛋白質等分解成氨基酸，參與到生物的氮素代謝過程中，是促進土壤氮循環的重要因素。不同的施肥處理后，土壤中蛋白酶活力增加。單施N后，土壤蛋白酶活力最高，且與其他處理后的酶活力有著顯著差異。不同比例的P和M配施時，施加50%P+M時蛋白酶活力較高。0～10 cm土層中蛋白酶活力高于10～20 cm土層(圖5)。在0～10 cm土層中，蛋白酶活力增加明顯，施加N后，土壤中的蛋白酶活力為17.70 mg/g，增加量為103%，與對照和其他施肥處理有著顯著差異。不同比例的P與M配施后的蛋白酶活力低于單施P和M后的酶活力。在10～20 cm土層，所有施肥處理的土壤蛋白酶活力增加，增加量為14.2%～65.5%。P與M配施后的蛋白酶活力高于單施P后的酶活力，但低于單施M時的酶活力。

2.6土壤微生物與土壤酶之間的相關性研究土壤微生物的變化必然會影響土壤酶的變化，二者之間存在著相關性[18]。對土壤微生物與土壤酶之間的相關性研究表明(表2)，0～10 cm土層，細菌與放線菌，脲酶與細菌、真菌，蛋白酶與過氧化氫酶之間均顯著正相關。在10～20 cm土層，細菌與放線菌、脲酶與蔗糖酶之間均極顯著正相關，脲酶與細菌之間顯著正相關。總之，不同施肥處理后各土層土壤微生物與土壤酶之間存在不同程度的相關性。

試驗發現，土壤微生物和土壤酶之間有著密切的關系。施肥使得土壤微生物數量發生變化，進而間接的對土壤酶產生影響。

表2　土壤微生物與土壤酶之間的相關性分析

注：*表示P<0.05;**表示P<0.01;X1為細菌；X2為放線菌；X3為真菌；X4為過氧化氫酶；X5為脲酶；X6為磷酸酶；X7為蔗糖酶；X8為蛋白酶

3討論與結論

許多研究報道[19-21]，土壤理、化性質的差異會引起土壤微生物的種類及數量、土壤酶等的變化。試驗發現，施肥后同一土層或不同土層，土壤中的3大類微生物(細菌、放線菌、真菌)數量和土壤酶活性存在較大差異。土壤中3大類微生物數量均表現為：細菌數量最多，放線菌次之，真菌最少,這與姚拓等[22]研究的天祝高寒草地中微生物數量的結果相一致。0～10 cm土層中微生物總數明顯多于10～20 cm土層，此結果與劉恩科等[23]研究一致。施肥后，土壤中細菌、真菌、放線菌數量和微生物總數均增加，說明施肥是影響土壤微生物種類和數量的一種重要管理措施。P與M配施后，土壤中細菌、放線菌數量和土壤微生物總數高于單施磷肥或混合菌肥后的數量，說明P與M配施改善了土壤微生物的環境，更有利于土壤微生物的生長發育和繁殖，從而數量增加。不同比例的P與M配施時，在施加等量M的基礎上，配施中等量的磷肥(50%P)時，細菌、真菌數量高于單施P和M后的數量。說明中等量的P與M配施后更利于增加土壤中的細菌數量。施加較低量的磷肥(25%P)時，放線菌數量高于單施P和M后的數量，說明較低量的P與M配施后更利于土壤中放線菌的生長。

土壤酶參與到土壤中的各種生物化學反應，對土壤中植物養分的轉化起著重要作用。已有不少研究發現，不同的施肥和耕作等管理措施對土壤酶有明顯的影響，試驗分析了施肥對土壤酶活性的影響。施肥對土壤過氧化氫酶活性影響較小，而且在各處理之間酶的活性沒有顯著差異，說明影響過氧化氫酶活力的主要因素并不是施肥，諸如試驗地的氣候、土壤質地、施肥種類和施肥量等的不同而造成的。漆良華等[24]、鄭詩樟等[25]研究表明，土壤微生物類群、土壤酶活性呈現出隨土層加深而減少的趨勢。研究發現，除過氧化氫酶外，其他土壤酶和土壤微生物均符合此規律。

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Effect of combined application of phosphate and microbial fertilizer on soil microbial quantity and soil enzyme activity in alpine region

CHEN Juan-li，SHI Shang-li，QI Juan

(CollegeofPrataculturalScience，GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability，Lanzhou730070，China)

Abstract：The alfalfa (Medicago sativa cv. Gold queen) was used to study the effects of phosphate fertilizer and microbial fertilizer on soil microbial quantity and soil enzyme activity in alpine region. Results showed that the soil microorganisms number (bacteria，fungi，actinomycete)，urease and invertase，protease activity were increased after fertilization treatments in different soil layers (0 to 10 cm，10 to 20 cm). The number of bacteria was more than actinomycetes，and which was followed by fungi. The number of microorganisms in 0 to10 cm soil layer was higher than that in 10 to 20 cm. The number of bacteria and actinomyces in treatment of phosphorus + mixed microbial fertilizer were higher than those in treatment of single phosphorus fertilizer and mixed microbial fertilizer. After applying 50% phosphorus and mixed microbial fertilizer，the number of bacteria and fungi were the largest. Urease，invertase and alkaline phosphatase and protease in 0 to 10 cm soil layer were higher than those in 10 to 20 cm. However，the hydrogen peroxide enzyme activity in 10 to 20 cm soil layer was higher than that in 0 to 10 cm. Urease activity in treatment of phosphorus + mixed microbial fertilizer was higher than other treatments. The microorganisms correlated to soil enzymes after fertilization.

Key words：alfalfa，microbial fertilizer，soil microorganism，soil enzyme

中圖分類號：S 146

文獻標識碼：A

文章編號：1009-5500(2016)01-0007-07

作者簡介：陳娟麗(1988-)，女，甘肅定西人，在讀碩士。

基金項目：公益性行業(農業)科研專項(201003023)，現代農業產業技術體系建設專項資金(CARS-35)資助

收稿日期：2015-04-17； 修回日期：2015-04-29

E-mail：juanlic@163.com

師尚禮為通訊作者。