18個早熟禾品種SSR指紋圖譜的構建

趙閆閆，喻　鳳，李　媛，竇全文

(中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧　810000)

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18個早熟禾品種SSR指紋圖譜的構建

趙閆閆，喻鳳，李媛，竇全文

(中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧810000)

摘要：利用從草地早熟禾(Poa pratensis)基因組中開發出來的3對多態性SSR引物，對18個早熟禾品種進行分子指紋圖譜鑒別研究。結果表明：3對引物在18個品種中共檢測出16個多態性片段，每對引物可以檢測到4至6個數目不等的片段，平均為5.33個，片段大小介于152至227 bp。利用單一引物可將18個品種區分為5～11種類型，平均為8.33個類型。利用這3對SSR多態性引物指紋圖譜可以將18個品種完全區分開。研究構建的指紋圖譜可作為對文中18個早熟禾品種進行區分的重要參考依據，同時篩選出的對核心引物也可以用來構建其他早熟禾品種的指紋圖譜。

關鍵詞：早熟禾；SSR標記；指紋圖譜；品種鑒別

早熟禾屬(Poa)為禾本科早熟禾亞科，全世界約有500多種，我國早熟禾資源豐富，約有100多種，廣泛分布于西北、華北、東北等地區。早熟禾屬內多數植物再生能力強、繁殖力強、耐寒、耐旱，而且營養豐富、綠色周期長，不少種是天然和人工種植利用的優質牧草，也是草坪綠化常用植物[1,2]。我國的早熟禾育種起步較晚，一些早熟禾品種都是在我國本土遺傳資源基礎上選育出的，其具有良好的環境適應特性，在牧草生產以及生態環境恢復中起著不可替代的作用，如在青藏高原地區人工種植利用青海草地早熟禾(P.pratensis)、青海扁莖早熟禾(P.pratensisvar.anceps)、以及青海冷地早熟禾(P.crymophila)等[3-6]。

在對早熟禾實際應用中，需要針對不同生態環境和不同利用目的選擇性地利用不同的品種，但早熟禾的表型性狀區別不明顯，通過形態很難鑒別這些品種[7]。20世紀90年代DNA指紋圖譜技術就是有效的分子手段，克服了易受環境影響、周期長、工作量大等傳統鑒定手段的缺點，可以對品種真實性和純度進行快速、準確的鑒定[8]。在早熟禾早期的指紋圖譜的研究中，研究者利用RAPD、AFLP、ISSR等分子標記技術對早熟禾進行品種分類和多樣性鑒定[1,2,9-12]，但是有研究結果表明，利用某些分子標記的品種鑒定結果與形態鑒定結果不一致[9]。Honig等[13]于2010年首次從草地早熟禾基因組DNA中分離得到了88個多態性SSR分子標記，進一步利用其中22個標記對247個品種和材料進行分類研究，結果表明SSR分子標記分類結果與形態學分類、以及系譜分析等具有很好的一致性[14]。

筆者在試驗室開發出的15對多態性SSR分子標記基礎上[15]，篩選可用于品種指紋圖譜構建的多態性核心引物，并進一步利用這些核心引物對15個國外引進的草地早熟禾品種和3個青海本土早熟禾品種構建指紋圖譜。

1材料和方法

1.1供試材料

3個青海本土早熟禾品種種子由青海省牧草良種繁殖場提供，其他15個進口草地早熟禾品種購自相關牧草或草坪草種子供應公司(表1)。

1.2草地早熟禾葉片DNA提取

將所有試驗材料發芽，單粒種植于小缽中，待試驗需要時取其葉片提取DNA。采用文獻[16]改良CTAB法提取基因組DNA。每個品種隨機選取10株苗的葉片混合提取DNA。

1.3SSR-PCR擴增及檢測

SSR-PCR反應體系：總體系25 μL，DNA 1 μL (50 ng/μL)，10×PCR Buffer 2.5 μL (含Mg2+)，dNTP 2.0 μL (2.5 mmol/μL)，TaqDNA聚合酶0.3 μL (5 U/μL)，上下游引物均為0.5 μL (10 μmol/μL)，ddH2O 18.2 μL。擴增程序95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55～50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。所有反應在Applied Biosystems PCR儀上進行。PCR擴增產物在8%聚丙烯酰胺凝膠上用1×TBE緩沖液進行電泳分離，經EB稀釋液染色后，用Bio-Rad自動成像系統照相，后將所得的SSR譜帶和數據進行分析。

表1　18個早熟禾品種

注：1，17，18序號的品種原于青海，2～16序號的品種來源于美國

2結果與分析

2.1多態性引物篩選

在草地早熟禾中開發出的15對多態性SSR標記引物中，有13對引物在扁莖早熟禾中有擴增產物，同時在這13對中有7對SSR引物在青海冷地早熟禾中有擴增產物[15]。利用這15對SSR引物進一步對18個早熟禾品種進行多態性分析，篩選出多態性豐富、擴增條帶穩定、清晰的引物3對(表2)。

表2　多態性SSR引物

利用篩選出的3對引物在18個品種中共檢測出16個多態性片段，每對引物可以檢測到4～6個數目不等的片段，平均為5.33個，片段大小為152～227 bp (表3)。

表3　18個早熟禾品種中檢測到的SSR標記片段

2.2指紋圖譜構建

利用篩選到的核心引物對18個早熟禾品種進行指紋圖譜的構建，其中利用引物Poap10的指紋圖譜如圖1所示。進一步將3對引物對8個品種指紋圖譜加以數字化制成表格，如表4所示。單獨利用SSR引物Poap5根據帶型組合可以將18個品種分類成5種類型，利用引物Poap9可以將18個品種分成9種類型，利用引物Poap10也可以將18個品種分成不同的11種類型。利用引物組合Poap5和Poap9、以及利用Poap5和Poap10可以將18個品種中12個品種進行準確區分，利用引物組合Poap9和Poap10可以將18個品種中14個品種進行區分，聯合應用這3對應物可以將18個品種中每一個品種進行準確區分。

圖1　SSR引物Poap10 在18個早熟禾品種中的電泳圖Fig.1　Electrophoresis of 18 cultivars by using SSR marker Poap10注：M為DNA分子量marker；1～18為不同早熟禾品種，序號與表1一致

表4　3對引物在18個早熟禾品種的SSR指紋圖譜

3討論與結論

草地早熟禾為早熟禾類植物中利用最為廣泛的物種，由于其兼性無融合生殖特性，草地早熟禾在染色體數目上呈現較高的變異性，在群體中有不同倍性以及非整倍體個體的存在[17,18,19]，這種復合多倍體使得草地早熟禾種內具有很高的遺傳多樣性[20]。從草地早熟禾基因組中開發的基因組SSR標記在草地早熟禾不同材料間呈現很高的多態性，檢測到的SSR標記等位基因平均數量隨著檢測材料數量和標記數量的增多呈顯著上升趨勢，試驗中利用3個SSR標記對18個品種進行檢測，檢測到多態性平均為5.33個，Honig等利用25個SSR標記對247個品種(材料)進行多態性分析，檢測到的多態性位點平均為16.04個[11]，利用88個SSR標記對265個品種(材料)進行多態性分析，88個SSR標記能夠檢測到的等位基因位點平均為38.83個[12]。同時，由于草地早熟禾群體遺傳結構組成的特殊性，利用同一引物在不同個體或同一個體中有可能檢測到1個以上的等位基因位點，草地早熟禾的這種變異特性，極大地提高了SSR標記對不同品種和材料的分辨能力。

試驗研究中18個早熟禾品種中，16個品種為草地早熟禾品種，其他2個品種分別為扁莖早熟禾和冷地早熟禾品種，而利用的3個SSR標記是從草地早熟禾中開發出來的，其中，2個標記在扁莖早熟禾和冷地早熟禾中有擴增產物，1個標記沒有擴增產物，標記Poap5可以顯著地將扁莖早熟禾、冷地早熟禾品種與其他草地早熟禾品種區分出來，進一步可以利用Poap9可將扁莖早熟禾品種和冷地早熟禾品種進行區分。由于迄今只有少量其他早熟禾物種中具有可供利用的SSR標記[21]，因此，在其他早熟禾物種品種鑒別中借鑒利用從草地早熟禾中開發出來的SSR標記，不失為一種簡便、快速的手段。

SSR分子標記指紋圖譜技術已經在小麥、水稻、玉米等農作物品種中得到廣泛應用，由于SSR分子標記技術在早熟禾研究中起步較晚，利用SSR分子標記對早熟禾品種進行指紋圖譜鑒定鮮見報道，在本研究中嘗試利用SSR分子標記對18個早熟禾品種進行鑒別，結果表明由于早熟禾的高變異特性，利用少量的SSR標記就可以實現對不同品種的準確區分。同時，SSR標記具有檢測操作過程簡便、結果穩定等優點，相信SSR指紋圖譜構建技術在早熟禾品種鑒別中將會得到越來越廣泛的應用。

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Fingerprint establishment of 18Poapratensiscultivars with SSR markers

ZHAO Yan-yan，YU Feng，LI Yuan，DOU Quan-wen

(NorthwestInstituteofPlateauBiology，ChineseAcademyofSciences，Xining810000，China)

Abstract：The fingerprint of 18 Poa pratensis cultivars was established by using 3 polymorphic simple sequences repeat (SSR) markers developed from genomic DNA of P. pratensis. Totally 16 polymorphic SSR fragments were detected in all tested cultivars，and 4 to 6 alleles were detected by each pair of SSR primer with an average of 5.33. The band size varied from 152 bp to 227 bp. 18 cultivars could be divided into 5 to 11 groups by single polymorphism primer，with an average of 8.33. 18 cultivars could be distinguished thoroughly by the fingerprinting maps constructed by the 3 pairs of SSR primers. The constructed fingerprinting maps are important references to discriminate the 18 tested cultivars. Furthermore，the screened 3 polymorphic SSR markers can be useful to establish fingerprint for other cultivars.

Key words：P. pratensis；SSR marker；fingerprinting；cultivar identification

中圖分類號：Q 789

文獻標識碼：A

文章編號：1009-5500(2016)01-0031-05

作者簡介：趙閆閆(1990-)，女,安徽蚌埠人，在讀碩士生。

基金項目：青海省科技廳科技促進新農村建設計劃項目(2013-N-515)資助

收稿日期：2015-05-28； 修回日期：2015-12-03

E-mail：yanyanziji@126.com

竇全文為通訊作者。