丙泊酚通過抑制小鼠海馬神經元突觸釋放組織纖溶酶原激活物引起神經毒性損傷

梁超　倉靜　薛張綱

(復旦大學附屬中山醫院麻醉科，上?！?00032)

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·論著·

丙泊酚通過抑制小鼠海馬神經元突觸釋放組織纖溶酶原激活物引起神經毒性損傷

梁超倉靜薛張綱

(復旦大學附屬中山醫院麻醉科，上海200032)

摘要目的： 明確丙泊酚對體外培養的發育期新生小鼠海馬神經元釋放組織纖溶酶原激活物(tPA)的影響，并進一步探討加入外源性tPA能否逆轉丙泊酚對發育神經元的毒性損傷作用。方法： 將體外培養的發育期小鼠海馬神經元分為4組：對照組(C組)、丙泊酚組(Pro組)、tPA組和丙泊酚+tPA組(Pro+tPA組)。C組不做任何處理；Pro組在培養液中加入丙泊酚，終濃度為5、10、30 μmol/L，繼續孵育不同的時間(1 h、2 h、3 h、6 h)；tPA組在培養液中加入tPA，終濃度為1 μmol/L，繼續孵育6 h；Pro+tPA組在在培養液中同時加入tPA(終濃度1 μmol/L)及丙泊酚(終濃度10 μmol/L)，繼續孵育6 h。檢測各組神經元凋亡率及凋亡指標actived-caspase-3蛋白的表達情況。結果： Pro組神經元的凋亡率及actived-caspase-3蛋白的表達水平較C組顯著上調(P<0.05)。Pro組tPA水平顯著低于C組(P<0.05)。Pro+ tPA組的神經元的凋亡率及actived-caspase-3蛋白的表達水平顯著低于Pro組(P<0.05)。結論： 丙泊酚可通過抑制神經元釋放tPA而對體外培養的新生小鼠發育期海馬神經元產生毒性損傷作用，外源性加入tPA可部分逆轉丙泊酚的神經毒性作用。

關鍵詞丙泊酚;發育期神經元;毒性損傷

Propofol Induces Neurotoxicity by Inhibiting tPA Release of Neuronal Synapse in Mouse Hippocampus

LIANGChaoCANGJingXUEZhanggang

DepartmentofAnesthesiology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective： To explore the effect of propofol on the tPA release of hippocampal neurons in developing mice, so as to investigate whether exogenous tPA could reverse the propofol-induced neurotoxicity on developing neurons.Methods： The hippocampal neurons of developing mice cultured in vitro were divided into 4 groups(n=20 each)：control group(group C)，propofol group(group Pro), group tPA and propofol plus tPA group(group Pro+tPA)．There was no specific treatment in group C. In group Pro，propofol was added to the culture media with the final concentration of 5,10, 30 μmol/L, respectively, and the cells were then incubated for 1 h, 2 h, 3 h, 6 h, respectively．In group tPA，tPA was added to the culture media with the final concentration of 1 μmol/L，and the cells were then incubated for 6 h．In group Pro+tPA, both propofol and tPA were added to the culture with the final concentration of 10 μmol/L and 1 μmol/L,respectively, and the cells were then incubated for 6 h.The neuron apoptosis rate and the expression level of actived-caspase-3 protein were detected in each group.Results： Compared with that in group C，the apoptosis rate and the expression level of actived-caspase-3 protein in group Pro significantly increased (P<0.05)．The tPA level in group Pro was significantly higher than that in group C(P<0.05). Compared with that in group Pro，the apoptosis rate and the expression level of actived-caspase-3 protein in group Pro+tPA significantly decreased (P<0.05).Conclusions： Propofol induces neurotoxicity on hippocampal neurons of developing mice cultured in vitro by inhibiting neuronal tPA release. And exogenous tPA could partially reverse propofol-induced neurotoxicity.

Key WordsPropofol;Developing neurons;Neurotoxicity

發育期個體暴露于全麻藥后所造成的遠期神經行為和學習能力損害與全麻藥物對發育期神經元產生的毒性損傷作用相關[1-2]。以往的研究發現，丙泊酚對發育期神經元具有促凋亡作用[3]，并會對動物遠期的空間學習記憶能力產生負面影響[4]。消除丙泊酚對發育期神經元的毒性損傷作用可能是防治其遠期損害的關鍵，在此前提下，明確丙泊酚對發育期神經元產生毒性損傷的分子機制顯得尤為重要。目前已知，腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)具有促進神經元外生長和凋亡的雙重作用。BDNF在神經接頭的囊泡內以前體(proneurotrophin BDNF, proBDNF)形式存在；在proBDNF釋放入突觸間隙后，其被間隙中的纖溶酶裂解為成熟型BDNF(mature BDNF，mBDNF)；纖溶酶主要由突觸前囊泡所釋放的組織纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator, tPA)裂解纖溶酶原而生成[5]。mBDNF可觸發促存活信號通路，加快神經突生長，促進突觸的成熟和穩定[6]。而proBDNF激活促凋亡信號通路，抑制軸突生長，誘發生長錐崩潰和細胞凋亡[7]。因此，突觸間隙中proBDNF與mBDNF含量的比例在一定程度上決定神經元生長發育的方向。突觸中tPA的釋放依賴于神經活動[8]，而全身麻醉藥物本身可抑制神經活動，但未知全麻藥物是否會影響突觸tPA的釋放。本研究旨在明確丙泊酚對體外培養的發育期新生小鼠海馬神經元tPA釋放的影響，并且進一步觀察加入外源性tPA能否逆轉丙泊酚對發育期神經元的毒性損傷作用。

1資料與方法

1.1新生小鼠海馬神經元的體外培養取新生BALBc小鼠(由中國科學院神經科學研究所動物實驗中心提供)10只，斷頭取腦，分離海馬組織；用胰蛋白酶消化15 min后，加入含血清的培養液(90%DMEM、10%胎牛血清、0.2 mol/LL-谷氨酰胺、100 μg/mL鏈霉素及100 U/mL青霉素)終止消化，離心后棄上清液；加入含血清培養液并過濾；臺盼藍染色并計數，調整活細胞終濃度為5×104個/mL。將細胞種植于L-多聚賴氨酸包被的96孔板和放有圓形玻片的24孔板中，加入維持培養液[98%Neurobasal培養液(美國Gibco公司)、2%B-27 Supplement(美國Gibco公司)、0.2 mol/LL-谷氨酰胺、100 μg/mL鏈霉素及100 U/mL青霉素]，于37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養。

1.2分組及處理將體外培養的新生小鼠海馬神經元分為4組：對照組(C組)、丙泊酚組(Pro組)、tPA組和丙泊酚+tPA組(Pro+tPA組)。C組不做任何處理，Pro組在培養液中加入丙泊酚(批號：JR045，意大利AstraZeneca公司)，使丙泊酚終濃度為5、10、30 μmol/L，繼續孵育不同的時間(1 h、2 h、3 h、6 h)。tPA組在培養液中加入tPA，tPA終濃度為1 μmol/L，繼續孵育6 h。Pro+tPA組在培養液中同時加入tPA(終濃度1 μmol/L)及丙泊酚(終濃度10 μmol/L)，繼續孵育6 h。將各組海馬神經元接種于6孔培養板，每組6孔，培養至第7天進行實驗。

1.3采用流式細胞術檢測神經元凋亡情況各組新生小鼠海馬神經元培養至第7天時，用胰酶消化，離心，棄上清液，將細胞數調整至(0.5～1.0)×106個/L，采用Annexin V-FITC/PI雙標記試劑盒(江蘇南京凱基生物科技發展有限公司)進行測定，每個樣本收集10 000個細胞熒光信號，用FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)檢測神經元凋亡情況，計算凋亡率。

1.4采用Western印跡法檢測actived-caspase-3蛋白的表達各組新生小鼠海馬神經元培養至第7天時，用細胞裂解液提取細胞總蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量。蛋白樣品以12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-SAGE)電泳分離，后轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。用含5%脫脂奶粉的l×TBST(Tris-buffered saline with Tween)稀釋actived-caspase-3抗體(稀釋度l∶800，美國CST公司)，常溫孵育1 h；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體(稀釋度1∶5000，美國Santa Cruz公司)，常溫孵育30 min，曝光成像。以GAPDH為內參。應用Quantity One 5.0軟件(美國Bio-Rad公司)進行分析，actived-caspase-3的條帶灰度值與內參GAPDH條帶灰度值的比值反映了actived-caspase-3蛋白的表達情況。

1.5采用酶聯免疫吸附試驗( ELISA) 檢測 tPA按tPA測定試劑盒(美國Gibco公司)說明書操作。

2結果

2.1丙泊酚對體外培養的發育期新生小鼠海馬神經元有毒性損傷作用丙泊酚與體外培養的新生小鼠海馬神經元共同培養6 h， Pro組神經元凋亡率較對照組顯著增加(P<0.05)，Pro組actived-caspase-3蛋白的表達水平較對照組顯著上調(P<0.05)。見圖1。

與C組比較，*P<0.05圖1　與對照組相比較，丙泊酚(10 μmol/L, 6 h)處理顯著增加神經元的凋亡率(圖A)和actived-caspase-3蛋白的表達水平(圖B)

2.2丙泊酚抑制發育期新生小鼠海馬神經元釋放tPA不同終濃度的丙泊酚(5 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L)與體外培養的新生小鼠海馬神經元共同培養6 h，均會抑制海馬神經元釋放tPA(P<0.05)。丙泊酚(10 μmol/L)與體外培養的新生小鼠海馬神經元共同培養不同的時間(0.5 h、1 h、4 h)，均會抑制海馬神經元釋放tPA(P<0.05)。見圖2。

與C組比較，?P<0.05圖2　丙泊酚以劑量(圖A)和時間(圖 B)依賴的方式增加體外培養的新生小鼠海馬神經元的tPA水平

2.3加入外源性tPA可部分逆轉丙泊酚對發育期小鼠海馬神經元產生的毒性損傷作用取體外培養的新生小鼠海馬神經元，同時加入丙泊酚(10 μmol/L)和tPA(1 μmol/L)培養6 h后發現，tPA可顯著減輕降低丙泊酚所造成的神經毒性損傷作用(P<0.05)。見圖3。

與Pro組比較 *P<0.05圖3　加入外源性tPA(1 μmol/L)可抑制丙泊酚在新生小鼠海馬神經元所誘發的凋亡率增加和actived-caspase-3蛋白的表達水平上調

3討論

本研究證實，丙泊酚對體外培養的發育期小鼠海馬神經元有毒性損傷作用，使海馬神經元凋亡率增加、actived-caspase-3蛋白表達水平增加。caspase-3處于凋亡級聯反應的下游，它是細胞凋亡過程中的主要效應因子，其活化是凋亡進入不可逆性階段的標志。因此，actived-caspase-3蛋白表達水平增高與神經元的凋亡密切相關。

既往研究[5]認為，丙泊酚對新生小鼠海馬神經元的毒性損傷作用部分是通過激動GABAA受體使L型鈣離子通道開放而介導的。最近的研究[8]表明，阻斷發育期小鼠神經營養因子受體p75(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)能夠抑制丙泊酚所引起的caspase 3表達上調，逆轉其對神經生長的抑制作用。p75NTR是神經營養因子的低親和力受體，主要在神經細胞早期發育過程中豐富表達，它可通過不同的信號轉導通路誘導以神經細胞為主的增殖、凋亡、突觸建立和神經網絡形成。因此，p75NTR有望成為消除(降低)丙泊酚對發育期神經元的毒性損傷作用的有效靶點。然而，有關丙泊酚通過p75NTR抑制神經元生長發育的突觸內外分子機制尚不明確[9]，這就使得圍繞p75NTR上下游信號分子對丙泊酚神經毒性損傷作用進行系統防治存在一定困難。

由于全麻藥物可抑制神經元沖動發放，加之tPA的釋放依賴于神經沖動，本研究觀察了丙泊酚對體外培養的新生小鼠海馬神經元tPA釋放的影響。結果表明，丙泊酚可抑制發育期小鼠海馬神經元釋放tPA。進一步研究發現，加入外源性tPA可部分逆轉丙泊酚對發育期海馬神經元的毒性損傷。因此，驗證了我們的假設：即丙泊酚通過抑制小鼠海馬神經元突觸tPA釋放，進而減少纖溶酶生成，造成proBDNF向mBDNF的轉化減少，導致proBDNF-p75NTR信號通路占優勢，從而引起神經元毒性損傷及與海馬區功能相關的遠期學習記憶能力損害。所以，tPA有潛力成為防治丙泊酚對發育期神經元毒性損傷的新的干預靶點。然而，本研究未驗證小鼠體內丙泊酚對tPA釋放的影響，也未研究加入外源性tPA能否在體內逆轉丙泊酚的神經毒性損傷作用，對此尚有待進一步研究。此外，proBDNF-p75NTR信號通路中的其他突觸內外信號分子靶點在丙泊酚對發育期神經元毒性損傷中的作用可能是今后的研究方向。

綜上所述，丙泊酚可對體外培養的發育期小鼠海馬神經元產生毒性損傷作用，丙泊酚可抑制神經元tPA的釋放，加入外源性tPA可部分逆轉丙泊酚的神經毒性作用。

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中圖分類號R971+2

文獻標志碼A

通訊作者梁超，E-mail: superwm226@aliyun.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(編號：81400930)；上海市衛生和計劃生育委員會青年科學基金項目(編號：20144Y0234)；復旦大學附屬中山醫院青年基金項目(編號：2014ZSQN27)；復旦大學附屬中山醫院優秀青年計劃資助項目(編號：2015ZSYXQN19)