日本囊對蝦Na-K-2Cl共同轉運蛋白基因的克隆與組織表達分析

劉洪濤，王　軍，毛　勇，喬　瑩，鐘聲平，蘇永全

(廈門大學海洋與地球學院，福建廈門361102)

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日本囊對蝦Na-K-2Cl共同轉運蛋白基因的克隆與組織表達分析

劉洪濤，王軍，毛勇，喬瑩，鐘聲平，蘇永全*

(廈門大學海洋與地球學院，福建廈門361102)

摘要:利用反轉錄PCR( RT－PCR)和cDNA末端快速擴增( RACE)等技術在鰓組織中獲得日本囊對蝦( Marsupenaeus japonicus) Na－K－2Cl共同轉運蛋白( NKCC) cDNA全序列，包含14 bp的5'非編碼區( 5'－UTR)、201 bp的3'－UTR和3 183 bp的開放閱讀框( ORF)．該ORF共編碼1 060個氨基酸，預測蛋白分子質量為117．051 ku，理論等電點為6．57，命名為Mj－NKCC．預測Mj－NKCC二級結構由10個跨膜區組成，跨膜區的氨基酸序列和布局均相對保守．同源對比結果顯示，Mj－NKCC的氨基酸序列與夏威夷海蝕洞蝦( Halocaridina rubra)的Na－K－2Cl共同轉運蛋白相似度最高，為77%．系統進化分析表明Mj－NKCC與夏威夷海蝕洞蝦、藍蟹( Callinectes sapidus)等甲殼動物的NKCC聚為一支．實時熒光定量PCR( qRTPCR)分析表明，Mj-NKCC基因在肝胰腺、鰓、胃、腸、心、眼柄、肌肉和血細胞中均有表達，鰓組織中表達量最高;在鹽度驟變時，該基因表達變化顯著，表明其很可能參與了對蝦的滲透壓調節，在對蝦的滲透平衡中發揮重要作用．

關鍵詞:日本囊對蝦; Na－K－2Cl共同轉運蛋白( NKCC) ;基因克隆;組織表達;鹽度驟變

日本囊對蝦( Marsupenaeus japonicus)屬甲殼綱( Crustacea)，十足目( Decapoda)，對蝦科( Penaeidae)，囊對蝦屬( Marsupenaeus)，在我國黃海、東海和南海海域均有分布，是我國重要的經濟養殖蝦類［1］．日本囊對蝦屬海水廣鹽性對蝦，適宜的鹽度范圍是15～34，但對水體鹽度的變化較為敏感．陳堅等［2］研究發現低鹽度對日本囊對蝦生長和存活率的影響較為明顯．李才文等［3］證實鹽度變化能夠影響對蝦的免疫狀況，鹽度升降和偏離正常生存鹽度范圍均使對蝦抗感染力降低，成為病毒病爆發的重要誘因．因此，研究日本囊對蝦對鹽度的滲透調節機制具有重要的理論意義和生產應用價值．

Na－K－2Cl共同轉運蛋白( NKCC)是動物中廣泛存在的一類電中性離子跨膜轉運蛋白，基本上均以1Na∶1K∶2Cl的形式負責同向跨膜轉運Na、K、Cl離子進出上皮細胞與非上皮細胞，在上皮細胞離子轉運、細胞體積和離子濃度的維持和調節、滲透壓平衡和神經內分泌調控等方面均發揮重要生理功能［4］．NKCC基因在高等脊椎動物中研究已較為深入，而無脊椎動物中研究較少．Sun等［5］研究果蠅( Drosophila melanogaster)時發現一個CG4357蛋白，其與SLC12家族的第一分支存在較高的同源性，經證實其確為NKCC的昆蟲同源類似物．目前在藍蟹( Callinectes sapidus)、岸蟹( Carcinus maenas)、張口蟹( Chasmagnathus granulata)和中華絨螯蟹( Eriocheir sinensis) 4種蟹類和1種夏威夷海蝕洞蝦( Halocaridina rubra)中已獲得NKCC基因序列，且其表達隨鹽度變化上調［6－8］，但尚未見對蝦類NKCC基因的相關報道．本實驗成功克隆日本囊對蝦NKCC基因( Mj-NKCC) cDNA全序列，并分析其在日本囊對蝦不同組織中的表達，以及在環境鹽度發生驟變時的表達變化，可為研究甲殼動物離子通道與滲透調節機制積累基礎資料．

1材料與方法

1. 1實驗材料和試劑

實驗用日本囊對蝦購自福建省漳州市東山縣，體長為( 10．44±0．12) cm，體質量為( 14．05±0．86) g，暫養于2．5 m×2 m×1．5 m室內水泥池中．暫養一周后，隨機選取6尾身體完整無損傷的健康個體，取其肝胰腺、鰓、胃、腸、心、肌肉、眼柄和血細胞迅速置于液氮中保存備用．

RNAiso Plus總RNA提取試劑、PrimerScriptTM反轉錄酶、pMD19－T載體、Taq酶、TdT末端脫氧核苷酰轉移酶、Ex Taq酶、dATP、PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Dimer EraserTM均購自寶生物工程(大連)有限公司( TaKaRa) ; DNA純化通用試劑盒、高效感受態細胞制備試劑盒購自廈門鷺隆生物有限公司;其他常用試劑耗材購自廈門太陽馬生物有限公司．

表1日本囊對蝦NKCC基因克隆與表達分析所用引物Tab．1 Primers used for cloning and expression analysis of Mj-NKCC gene

1. 2引物設計

以日本囊對蝦轉錄組數據庫中與NKCC基因高度相似的unigene片段作為模板，利用引物設計軟件Primer Premier 5．0［9－10］和分析軟件Oligo 6．0設計中間片段擴增引物，并利用克隆獲得的cDNA片段分別設計cDNA 3'末端快速擴增( 3'－RACE)和5'－RACE巢式PCR引物．以日本囊對蝦翻譯延伸因子基因( EF1-α)作為內參基因，根據獲得的Mj-NKCC全長cDNA序列設計實時熒光定量PCR( qRT－PCR)引物．所有引物(表1)均由深圳華大基因有限公司合成．

1. 3 Mj-NKCC cDNA克隆

參照RNAiso Plus說明書提取日本囊對蝦鰓組織總RNA，取5 μL進行1%(質量分數，下同)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并使用ND－1000超微量紫外分光光度計測定其質量分數和純度．用于cDNA克隆的3'－RACE和5'－RACE模板參照孫田田等［11］實驗方法制備．

利用5對引物擴增和驗證Mj-NKCC cDNA的中間片段，PCR反應體系( 50 μL) :無菌雙蒸水( DDW) 37．5 μL，10×buffer 5 μL，dNTP ( 2．5 mmol/L each) 4 μL，正反向引物( 10 nmol/mL)各1 μL，Taq酶( 2．5 U/ μL) 0．5 μL，cDNA模板1 μL．PCR反應程序: 95℃5 min; 95℃45 s，55℃60 s，72℃90 s，36個循環; 72 ℃10 min．PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，將純化產物連接至pMD19－T載體，連接產物轉化至DH5α感受態細胞，菌液涂布于添加氨芐青霉素的LB固體平板上，37℃培養過夜，挑取陽性克隆測序即獲得目的片段序列．

利用3'－RACE的巢式PCR引物依次進行3'末端序列的擴增，PCR反應體系( 50 μL) : DDW 37．5 μL，10×buffer 5 μL，dNTP ( 2．5 mmol/L each) 4 μL，RA引物( 20 nmol/L) 1 μL，FF1/FF2引物( 10 nmol/mL)各1 μL，Ex Taq酶( 2．5 U/μL) 0．5 μL，cDNA第一鏈模板/第一輪巢式PCR稀釋產物1 μL．按照不同的引物設置適當的退火溫度來進行擴增，第二輪巢式PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，按照上文步驟進行克隆測序，所得即為3'末端序列．

利用引物RR1、RR2和Oligo dT－RA、RA，及制備的5'－RACE模板進行5'末端序列的巢式PCR擴增，操作步驟同3'－RACE．

隨著人們生活水平的提高，腦卒中偏癱患者對后期康復和生活質量改善的需求也日益增多，雖然在住院期間患者能夠享受較完善的護理服務，但出院后由于醫療條件和環境限制，其后續的護理需求難以保障。延續性護理通過對出院患者提供以人為中心的全方位整體護理，可滿足偏癱患者出院后的護理需求。

1. 4生物信息學分析

利用DNASTAR 5．0軟件對所得片段進行拼接和重疊序列的去除，確定開放閱讀框( ORF)區域并推導出相應氨基酸序列［12］．利用GenBank中BLAST工具( http:∥blast．ncbi．nlm．nih．gov/Blast．cgi)對所得的cDNA序列與核酸數據庫及蛋白質數據庫進行同源比對分析［13］．利用ClustalX軟件對核苷酸序列和氨基酸序列進行多重序列比對分析［14］．利用ProtParam程序( http:∥web．expasy．org/protparam/)統計氨基酸含量、預測理論分子質量和等電點．利用在線分析軟件SignalP 4．1 Server ( http:∥www．cbs．dtu．dk/services/ SignalP/)進行信號肽分析［15］．利用SMART ( http:∥smart．embl－heidelberg．de/)進行蛋白功能結構域分析．利用PSIPRED( http:∥bioinf．cs．ucl．ac．uk/psipred/)和PredictProtein( http:∥www．predictprotein．org/)分析蛋白質二級結構及活性調控位點．利用MEGA 6．06軟件的鄰接法( neighbor－joining，NJ)構建系統發育樹，分支置信度采用自展法( bootstrap analysis，BP)重復檢驗1 000次［16］．

1. 5 Mj-NKCC mRNA表達的組織分布檢測

按照上文1．3小節中實驗步驟提取日本囊對蝦肝胰腺、鰓、胃、腸、眼柄、心、肌肉、血細胞8種組織總RNA，并根據RNA總濃度添加適量的模板，按照PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書制備cDNA模板．

qRT－PCR按照SYBR?Premix Dimer EraserTM說明書配制反應體系，在ABI公司的7500快速實時熒光定量PCR系統上進行，每個樣品的目的基因和內參基因分別重復3次，同時設置未添加cDNA模板的陰性對照，PCR反應體系( 20 μL) : SYBR?Premix Dimer EraserTM( 2×) 10 μL，引物( 10 μmol/L)各0．6 μL，ROX Reference DyeⅡ( 50×) 0．4 μL，cDNA模板2 μL，DDW 6．4 μL．反應程序采用三步法: 95℃預變性30 s; 95℃3 s，60℃30 s，72℃30 s，40個循環，采集熒光信號; 60～95℃獲得熔解曲線．采用2－ΔΔCT法［17］用Excel 2013軟件分析表達數據，用Origin7．0軟件展示檢測結果．

1. 6 Mj-NKCC mRNA在鹽度驟變時表達變化的檢測

隨機選取100尾實驗對蝦于鹽度為25的水泥硬池中暫養2周，其他條件同1．1．將實驗對蝦平均分為2組，分別迅速轉移至鹽度為15和35的水泥池中，于0，3，6，12，24，48，72，96 h隨機選取5尾實驗對蝦，冰上解剖取鰓組織迅速置于液氮中保存備用．qRT－PCR實驗的設計和數據分析參照1．5小節．

2結　　果

將測序結果進行比對拼接獲得日本囊對蝦NKCC 的cDNA全序列( GenBank: KR063275)，命名為Mj-NKCC，其全長為3 398 bp(圖1)．Mj-NKCC的cDNA包括5'非編碼區( 5'－UTR) 14 bp，3'－UTR 201 bp，ORF 3 183 bp; 3'－UTR包含典型的加尾信號序列( AATAAA)和13 bp的poly( A)序列．

Mj-NKCC的ORF共編碼1 060個氨基酸(圖1)，包含有92個強堿性氨基酸( Arg和Lys)和95個強酸性氨基酸( Asp和Glu)．ProtParam預測顯示: Mj－NKCC蛋白分子質量為117．051 ku，等電點為6．57;預測GRAVY值為0．091，表明該蛋白為疏水蛋白;不穩定指數(Ⅱ)為36．90，顯示該蛋白是穩定存在的;脂肪族指數為98．70，表明該蛋白具有較高的耐熱性．Mj－NKCC存在多種功能位點，包括13個糖基化位點、3個c A M P / c G M P依賴蛋白激酶磷酸化位點、9個蛋白激酶C磷酸化位點、1 8個酪蛋白激酶C KⅡ磷酸化位點、1 6個豆蔻酰化位點和1個亮氨酸拉鏈基序．

圖1 Mj-NKCC的cDNA全長序列及推導的氨基酸序列Fig．1 The complete Mj-NKCC cDNA sequence and deduced amino acid sequence

利用SignalP4．1預測顯示Mj－NKCC蛋白的N端不存在信號肽，為非分泌蛋白．利用PSIPRED分析該蛋白的二級結構顯示其中α螺旋占43．30%，β折疊占10．19%，無規則卷曲結構占45．51%．利用Predict－Protein預測該蛋白亞細胞定位為細胞膜，可信度為76%．它具有10個跨膜區，分布在氨基酸序列的第123 ～583號殘基之間(圖1)，除第2，9，10個跨膜區為21，25，25個氨基酸殘基外，其他跨膜區均為18個氨基酸殘基，大片段的蛋白N末端和C末端均位于膜內側．膜外序列在第5和第6個跨膜區之間存在1個酪氨酸蛋白激酶磷酸化位點．

利用SMART分析發現該蛋白第120～634位氨基酸殘基之間有一個典型的Na－K－2Cl共同轉運蛋白AA _permease/SLC12A結構域．

2. 2 Mj-NKCC多重比對及系統進化樹分析

由Mj-NKCC cDNA序列推導的氨基酸序列與夏威夷海蝕洞蝦、藍蟹等近緣物種的NKCC多重序列比對結果(圖2)表明，其蛋白跨膜區及布局相對保守，C端序列也相對保守，暗示這些片段對蛋白功能可能發揮重要作用．利用BLAST同源比對分析也發現，Mj－NKCC與其他物種的NKCC具有較高的同源性，其中與夏威夷海蝕洞蝦的NKCC相似度最高，為77%．系統進化樹(圖3)顯示Mj－NKCC(圖中▲標示)首先與夏威夷海蝕洞蝦、藍蟹、岸蟹等節肢動物的NKCC聚為一支，再與長牡蠣( Crassostrea gigas)等軟體動物的聚在一起并相對脊椎動物獨立分支．

2. 3 Mj-NKCC mRNA的組織表達分析

qRT－PCR檢測Mj-NKCC mRNA在日本囊對蝦肝胰腺、鰓、胃、腸、心、肌肉、眼柄和血細胞8種組織中的表達，結果(圖4)顯示在8種組織中均有表達，以肝胰腺中表達量為對照，鰓中表達量最高，其后依次為血細胞、腸、胃、眼柄、心和肝胰腺，在肌肉中的表達量最低．

2. 4 Mj-NKCC mRNA在環境鹽度驟變時的表達變化

qRT－PCR檢測Mj-NKCC mRNA在日本囊對蝦應對環境鹽度發生驟變時的表達變化，結果見圖5．鹽度由25驟降至15后3 h，Mj-NKCC mRNA相比0 h(對照組)顯著上調表達，約為其2．8倍，6 h和12 h時均維持在與3 h相當的表達量;至24 h時，表達量進一步上調，相比0 h差異極顯著( p＜0．01)，約為其8．4倍;后雖有下調，但與0 h差異仍極顯著( p＜0．01) ;而在鹽度由25驟升至35后，Mj-NKCC mRNA表達量雖出現波動變化，但除72 h時的表達量相比0 h表現出顯著上調外( p＜0．05)，其他時間點的表達量與0 h差異均不顯著．

3討論

NKCC屬于電中性的陽離子－氯轉運家族( CCCs)，目前的研究表明該家族包括9種轉運子，分別為1個Na/Cl共轉運子、4個K/Cl共轉運子、2個Na/K/Cl共轉運子和2個尚不清楚功能的新發現的膜蛋白［18－19］．本實驗利用RT－PCR和RACE等技術，成功獲得日本囊對蝦NKCC基因( Mj-NKCC)的全長cDNA序列．NKCC為一類跨膜糖蛋白，分子質量為120～200 ku，Mj－NKCC經生物信息學預測定位在細胞膜上，氨基酸序列中含有13個N－糖基化位點，在胞內和胞外區域均有分布，與Reshkin等［20］在兔腮腺中的研究發現基本一致．同源分析表明Mj－NKCC與夏威夷海蝕洞蝦、藍蟹、果蠅等的NKCC同源性很高，其中與夏威夷海蝕洞蝦的NKCC相似度最高，為77%，說明NKCC在不同物種間較為保守．進一步系統進化分析顯示Mj－NKCC首先與甲殼動物NKCC聚為一個分支，后與果蠅等節肢動物和長牡蠣、玻璃海鞘等軟體動物的NKCC共同聚為一個大的分支，與高等脊椎動物明顯分開，表明借助NKCC的氨基酸序列對物種進行的分子進化研究與傳統的生物學分類基本吻合．

研究表明，NKCC蛋白功能的激活或抑制與該蛋白的磷酸化狀態息息相關．其活化后會促使其易位到胞膜上執行功能［21］．Darman等［22］研究了NKCC的N端磷酸化狀態對其蛋白的活性調控的影響，發現其末端存在多個磷酸化位點，可以與蛋白磷酸酶的SPAK、RVXF區域結合從而調控NKCC的活性;并發現Thr189的磷酸化對于HEK－293細胞表達的鯊魚( Squalus acanthias) NKCC蛋白的活性是必要條件，而Thr184和Thr202的磷酸化則起調控作用．Flatman等［23］在關于磷酸化和蛋白間相互作用對NKCC活性調控的研究中證實，NKCC中也存在蛋白激酶A、蛋白激酶C、酪蛋白激酶CKⅡ的結合位點．Diecke等［24］的研究還證實MAPKs、CaMKⅡ以及cAMP/cGMP－PK均可以使NKCC磷酸化．Mj－NKCC的氨基酸序列含有3 個cAMP/cGMP依賴型蛋白激酶磷酸化位點、9個蛋白激酶C磷酸化位點、18個酪蛋白激酶CKⅡ磷酸化位點、膜外序列在第5和第6個跨膜區之間有1個酪氨酸蛋白激酶磷酸化位點．因此Mj－NKCC磷酸化/去磷酸化狀態的調控，可能對其在日本囊對蝦滲透壓維持和調節、神經內分泌調控以及細胞周期等方面產生重要影響．

圖2 Mj－NKCC氨基酸序列的多重比對Fig．2 Amino acid sequences of Mj－NKCC aligned with the NKCC sequences from other species

CCCs家族中NKCC與其他轉運子在不同的物種間存在25%～67%的相似度，但二級結構均較為相似，跨膜區為8～12個疏水性氨基酸構成的螺旋，膜內區由親水性的N端和C端組成［25］．Mj－NKCC包含10個跨膜區，N端和C端均在細胞膜內．NKCC跨膜區的氨基酸組成和分布均相對保守，研究發現其N端序列相差較大但C端序列相對保守，不同物種間擁有65%的相同氨基酸組成［26］．Mj－NKCC與藍蟹、果蠅等的NKCC多重對比分析表明其跨膜區和C端序列均較為保守，N端序列不同物種間差異較大．跨膜區序列分析發現Mj－NKCC與其他物種相比第2，9，10個跨膜區長度變異較大，第2，4，5，6，7個跨膜區氨基酸差異較大，提示其可能與物種特異性有關．

Isenring等［27］通過構建鯊魚與人的NKCC嵌合體進行點突變實驗，發現NKCC基因的離子結合與轉運及bumetanide抑制結合的能力，都依賴相對保守的疏水跨膜結構．該跨膜結構在不同亞型乃至不同物種間都是非常保守的［28］．各跨膜區的離子動力學特性不同，可能具有物種特異性，其中第2個跨膜區的氨基酸突變會影響對Na、K等陽離子的親和力，而第4～7個跨膜區的氨基酸組成則對Cl離子的親和力起決定作用［29］．Mj－NKCC具有與CCCs家族NKCC高度同源的AA_permease/SLC12A結構域，且該結構域定位于跨膜區，并且根據上文分析Mj－NKCC第2，4，5，6，7個跨膜區序列與其他物種差異較大，推測這些跨膜區的氨基酸變異是日本囊對蝦廣鹽性適應的重要原因．Mj－NKCC各跨膜區的具體功能尚需進一步研究．

圖3基于NKCC氨基酸序列構建的NJ系統進化樹Fig．3 The neighbor－joining( NJ) phylogenetic tree constructed based on NKCC amino acid sequences

圖4 Mj-NKCC mRNA的組織表達分布Fig．4 Expression of Mj-NKCC mRNA in different tissues

海產甲殼動物，其對鹽度的適應能力主要體現在對滲透壓和離子濃度的調節能力上，而這種調節主要由鰓來完成．鰓的上皮含有顆粒細胞、腎原細胞、柱形細胞等多種細胞類型，從而調控和維持外界水環境與血淋巴的滲透平衡，執行呼吸、排泄、滲透壓調節甚至病害防御等功能，而位于這些細胞基底側質膜的NKCC的協同轉運將發揮重要作用［27－28，30－31］．利用qRT－PCR技術檢測NKCC基因在日本囊對蝦的鰓、肝胰腺、腸、血細胞、胃、心、眼柄和肌肉8種組織中的相對表達量，發現Mj-NKCC mRNA在這些組織中均有表達，在鰓中表達量最高．進一步的鹽度驟變實驗表明，Mj-NKCC mRNA在鹽度發生驟變時表達量出現明顯變化，在鹽度驟升后72 h和驟降后3～12 h表達量變化差異達到顯著水平，在鹽度驟降后24～96 h表達量變化差異達到極顯著水平，說明Mj-NKCC基因很可能參與了日本囊對蝦的滲透壓調節過程．有研究報告對夏威夷海蝕洞蝦多種滲透相關基因進行研究，發現NKCC除鹽度由32驟降至2時顯著地上調表達外，其他鹽度驟變的實驗組表達波動均不顯著，這可能與物種及環境不同有關，相比而言夏威夷海蝕洞蝦的環境鹽度變化更為劇烈與頻繁［8］．綜上所述，可以推測Mj-NKCC基因在日本囊對蝦鰓的離子轉運和滲透平衡中發揮重要作用．

圖5 Mj-NKCC mRNA在環境鹽度驟變時的表達Fig．5 Expression of Mj-NKCC mRNA after the salinity changes in environment

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Molecular Cloning and Expression Analysis of Na-K-2Cl Cotransporter from Marsupenaeus japonicus

LIU Hongtao，WANG Jun，MAO Yong，QIAO Ying，ZHONG Shengping，SU Yongquan*

( College of Ocean and Earth Sciences，Xiamen University，Xiamen 361102，China)

Abstract:Na－K－2Cl cotransporter gene ( Mj-NKCC) from Marsupenaeus japonicus was obtained using reverse transcription PCR( RT－PCR) and rapid amplication of cDNA ends ( RACE) in this study．Results show that the full－length cDNA sequence of Mj-NKCC consists of a 14－bp 5' untranslated regions ( 5'－UTR)，a 201－bp 3'－UTR and a 3 183－bp open reading frame ( ORF)．The deduced amino acids sequence is composed of 1 060 amino acids，with molecular weight of 117．051 ku and isoelectric point of 6．57．The predicted second structure of Mj－NKCC contains 10 transmembrane domains，which are highly conserved in sequences and localization sites compared to other species．Multiple alignments of the amino acid sequences show that Mj－NKCC has the highest homology with Callinectes sapidus ( up to 77%)，and the phylogenetic analysis indicated that it was first clustered together with C．sapidus and Carcinus maenas．Additionally，the quantitative real－time PCR ( qRTPCR) results displayed that Mj-NKCC was expressed in hepatopancreas，gills，stomach，muscle，heart，eyestalk，intestine and hemocytes，with the highest expression level in gills．As the salinity changed sharply，significant changes occurred in the expression of Mj-NKCC，indicating that Mj-NKCC putatively participates in osmotic balance of shrimps and plays an important role in osmoregulation of shrimps．

Key words:Marsupenaeus japonicus; Na－K－2Cl cotransporter ( NKCC) ; molecular cloning; tissue expression; salinity change

*通信作者:yqsu@ xmu．edu．cn

基金項目:國家高技術研究發展計劃( 863計劃) ( 2012AA10A409) ;國家星火計劃( 2015GA720002) ;國家蝦產業技術體系崗位專家項目( CARS－47) ;福建省科技廳區域重大項目( 2013N3004) ;廈門市南方海洋中心項目( 14CZY033HJ07)

收稿日期:2015－05－07錄用日期: 2015－09－16

doi:10．6043/j．issn．0438－0479．2016．01．009

中圖分類號:Q 785; S 917．4

文獻標志碼:A

文章編號:0438－0479( 2016) 01－0046－09

引文格式:劉洪濤，王軍，毛勇，等．日本囊對蝦Na－K－2Cl共同轉運蛋白基因的克隆與組織表達分析［J］．廈門大學學報(自然科學版)，2016，55( 1) : 46－54．

Citation: LIU H T，WANG J，MAO Y，et al．Molecular cloning and expression analysis of Na－K－2Cl cotransporter from Marsupenaeus japonicus［J］．Journal of Xiamen University( Natural Science)，2016，55( 1) : 46－54．( in Chinese)