曲張鏈菌素產生菌壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株遺傳操作體系的建立

宋姣姣，康前進，張連茹，吳瑩瑩，3*，白林泉

( 1．廈門大學生命科學學院，天然產物源靶向藥物國家地方聯合工程實驗室，福建廈門361102; 2．上海交通大學生命科學技術學院，微生物代謝國家重點實驗室，上海200240; 3．中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態研究所，合成生物學重點實驗室，上海200032)

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曲張鏈菌素產生菌壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株遺傳操作體系的建立

宋姣姣1，康前進2，張連茹1，吳瑩瑩1，3*，白林泉2

( 1．廈門大學生命科學學院，天然產物源靶向藥物國家地方聯合工程實驗室，福建廈門361102; 2．上海交通大學生命科學技術學院，微生物代謝國家重點實驗室，上海200240; 3．中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態研究所，合成生物學重點實驗室，上海200032)

摘要:曲張鏈菌素屬于安莎類抗生素，具有顯著的生物活性．在從壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株的發酵產物中分離和鑒定了多組分曲張鏈菌素的基礎上，探索和優化了外源DNA通過接合轉移進入壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株的操作方法和培養條件．以游離型質粒pJTU1278為載體，在體外構建了一個曲張鏈菌素酰胺合酶基因svaF敲除的質粒，通過接合轉移轉入到壯觀鏈霉菌NRRL2494野生型菌株中，所獲得的svaF基因缺失突變株失去了產生曲張鏈菌素的能力．該遺傳操作體系的成功建立和優化，使得在體內分析和鑒定曲張鏈菌素生物合成基因的功能成為可能，同時也為建立其他類似放線菌的遺傳操作體系提供了參考．

關鍵詞:壯觀鏈霉菌;遺傳操作體系;曲張鏈菌素;生物合成;酰胺合酶

放線菌所產生的次級代謝產物是天然活性物質的重要來源．曲張鏈菌素( streptovaricin)屬較早發現的安莎類抗生素，其組分A～E由Siminoff等［1］和Ravina［2］于1957年從壯觀鏈霉菌( Streptomyces spectabilis) NRRL2494菌株的發酵產物中首先分離，其中曲張鏈菌素A和C的基本化學結構在1968年得到純化和鑒定［3］．此后，科學家們還從其他壯觀鏈霉菌株中先后分離和鑒定了組分F，G，K，J，U等數個曲張鏈菌素的同系物［4－5］，發現這些化合物都有共同的芳香核－萘醌環結構(圖1粗體部分)．對曲張鏈菌素的生物合成進行初步研究發現，其以3－氨基－5－羥基苯甲酸( 3－amino－5－hydroxybenzoic acid，AHBA)為前體，經Ⅰ型聚酮合酶( polyketide synthaseⅠ，PKSⅠ)催化的10步縮合反應延伸形成聚酮脂肪長鏈，最終形成大環內酰胺結構并釋放［6］，這一聚酮鏈骨架的化學結構和合成過程與抗結核臨床藥物利福霉素相同．

由于曲張鏈菌素具有抑制RNA聚合酶和反轉錄酶( DNA聚合酶)的活性［7－9］，目前已發現其對結核分枝桿菌( Mycobacterium tuberculosis)和非結核分枝桿菌如堪薩斯分枝桿菌( M．kansasii)、鳥桿菌( M．avium)等都有顯著的抗菌活性［10－11］，并有抗病毒活性和優于環孢菌素A的免疫抑制功能［4］，但由于毒性較大而較少使用．隨著合成生物學的學科發展和技術創新，通過組合生物合成的策略對目標抗生素進行結構優化成為可能［12－14］．基于曲張鏈菌素良好的藥物開發前景，我們試圖發掘生物活性更好的新結構類似物并增加其產量，從而適應于工業化開發．成功建立抗生素產生菌的遺傳操作體系是對抗生素進行生物合成研究和結構改造的前提，但關于壯觀鏈霉菌的遺傳操作體系目前還未見報道．

以曲張鏈菌素產生菌壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株為對象，本文在了解其抗生素敏感性和生長速度快等特點的基礎上，發現縮短常規接合轉移時間和使用半營養培養基等方法對接合轉移有促進作用，并利用該遺傳操作體系成功實現了對曲張鏈菌素生物合成基因的敲除突變．

圖1曲張鏈菌素的化學結構式Fig．1 Chemical structures of streptovaricins

1材料與方法

1. 1材料

1. 1. 1菌株和質粒

產生曲張鏈菌素的壯觀鏈霉菌菌株NRRL2494、用于接合轉移的游離型質粒載體pJTU1278［15］、作為阿泊拉霉素抗性基因來源的質粒pJTU472［16］，由上海交通大學微生物代謝國家重點實驗室提供;構建克隆用載體pBluescriptⅡSK ( + )、宿主大腸桿菌( Escherichia coli)菌株TOP10、接合轉移的質粒供體大腸桿菌菌株ET12567/pUZ8002［17］，由第一作者單位保存．

1. 1. 2培養基

Luria－Bertani ( LB)培養基( g/L) :胰蛋白胨10，酵母抽提物5，氯化鈉10; pH 7．0．

TSBY培養基( g/L) :胰酪胨大豆肉湯培養基( TSB) 30，酵母抽提物10，蔗糖103; pH 7．2．

黃豆餅粉浸汁( SFM)培養基( g/L) :黃豆餅粉20，加入自來水滅菌后用4層紗布過濾，再加入甘露醇20; pH 7．5．

高氏一號培養基( g/L) :可溶性淀粉20，氯化鈉0．5，硝酸鉀1，硫酸亞鐵0．001，磷酸氫二鉀0．1，七水硫酸鎂0．5; pH 7．2．

Waksman培養基( g/L) :硫酸銨0．2，磷酸氫二鉀3．0，七水硫酸鎂0．5，七水氯化鈣0．126; pH 7．2．

壯觀鏈霉菌發酵( ZM)培養基［4］( g/L) :黃豆餅粉10，葡萄糖25，酵母粉2．5，氯化鉀4，磷酸氫二鉀0．1，硫酸銨5，牛肉浸膏1，碳酸鈣3．

ISP2和ISP3培養基配方見參考文獻［18］．

以上對應的固體培養基按20 g/L加入瓊脂．

1. 1. 3酶和主要試劑

酶和DNA分子質量標準購自TaKaRa公司，DNA回收試劑盒購自Omega公司，質粒回收試劑盒購自生工生物工程股份有限公司，其他常規試劑均為國產分析純產品．各種抗生素購自國內試劑公司，貯存質量濃度為:氨芐青霉素( ampicillin) 100 mg/mL，氯霉素( chloramphenicol) 25 mg/mL，卡那霉素( kanamycin) 25 mg/mL，硫鏈絲菌素( thiostrepton) 10 mg/mL，阿泊拉霉素( apramycin) 30 mg/mL，萘啶酮酸( nalidixic acid) 25 mg/mL，鏈霉素( streptomycin) 25 mg/mL．N－tris－(羥甲基)甲基－2－氨基乙磺酸( TES)緩沖液: TES終濃度0．05 mol/L，加入1 nmol/L氫氧化鈉溶液調節pH至8．0．PCR引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成，DNA測序由上海立菲公司完成．

1. 2方法

1. 2. 1壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株的抗生素敏感性檢測

采用SFM培養基，配制添加氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、硫鏈絲菌素、阿泊拉霉素、鏈霉素和萘啶酮酸7種抗生素的系列平板，終質量濃度梯度分別為5，25，50 mg/L．取新鮮的菌絲體劃線展開于各種抗生素濃度梯度的固體平板上，置于28℃培養箱中培養，從第3天開始至第7天進行生長情況觀察．

1. 2. 2酰胺合酶基因svaF敲除重組質粒pWY5構的建

壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株的基因組DNA參考文獻［19］的方法進行快速提取．根據所獲得酰胺合酶基因svaF的DNA序列，在基因的左右兩側各1 100 bp處分別設計2對引物，即左同源臂引物SvaFLF( 5'－AAAGGTACCGGCTCAGGGACGCCACCA－3'，引入BamHⅠ酶切位點)和SvaFLR ( 5'－AAAAAGCTTGTCCGGCGACTGGGCGACA－3'，引入HindⅢ酶切位點)，右同源臂引物SvaFRF( 5'－AAAAAGCTTGTCCTGCGCCGCGCCGTTGT－3'，引入HindⅢ酶切位點)和SvaFRR( 5'－AAAGGATCCGCCAGTCGCAGGGGAGCGG－3'，引入KpnⅠ酶切位點)．以曲張鏈菌素產生菌NRRL2494野生型菌株的基因組DNA為模板，分別用上述2對引物進行PCR，擴增出兩側同源交換臂片段;再根據兩端引入的限制性內切酶位點分別進行雙酶切，將這2個片段與經同樣酶切處理后的pBluescriptⅡSK( +)載體連接，構建重組質粒pWY1．測序驗證后以KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切pWY1，回收2．2 kb包含雙臂序列的片段，與經過相同酶處理的載體pJTU1278連接，構建重組質粒pWY4．用HindⅢ酶切質粒pJTU472，回收1．4 kb左右含有轉移原點oriT和阿泊拉霉素抗性基因aac( 3)Ⅳ的HindⅢ片段，連接至同樣經HindⅢ處理過的pWY4上，構建最后用于基因置換的質粒pWY5．將pWY5轉化到大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，獲得大腸桿菌ET12567/pUZ8002/pWY5，作為接合轉移的供體菌株．

1. 2. 3大腸桿菌供體菌株和壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株的接合轉移實驗

E．coli ET12567/pUZ8002/pWY5在6 mL含有相應終質量濃度的卡那霉素、氯霉素、阿泊拉霉素和氨芐青霉素的LB液體培養基中于37℃生長至600 nm下吸光度( OD600)為0．4～0．6時，離心收集菌體( 3 220 g，10 min)，用LB洗滌菌體2～3次后重懸于1 mL LB培養基中，作為接合轉移的供體菌株．壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株于SFM固體培養基上生長120 h，將孢子收集到TES緩沖液中，充分震蕩并過濾后以3 220 g離心5 min去除上清，將孢子重懸于5 mL TES緩沖液中，50℃熱激10 min，冷卻后加入等體積的預萌發液，37℃培養萌發2．5 h，3 220 g離心10 min收集菌體，懸浮于10 mL LB液體培養基中，作為接合轉移的受體菌株．將上述供體菌株和受體菌株分別進行顯微計數，按大腸桿菌細胞與壯觀鏈霉菌孢子數量相當的比例各取相應體積的懸液混合均勻，涂布于不含任何抗生素的半營養SFM固體培養基上，吹干，置于37℃培養8 h，用1 mL含有30 μg/mL阿泊拉霉素和25 μg/mL萘啶酮酸的無菌水均勻覆蓋整個平板，吹干表面水分后置于28℃培養，3～5 d后可觀察到接合子．

1. 2. 4壯觀鏈霉菌NRRL2494雙交換突變株的獲得

接合轉移平板上長出的接合子分別影印到含有硫鏈絲菌素和阿泊拉霉素的SFM固體培養基上，28℃培養3～5 d后，選取對硫鏈絲菌素敏感而對阿泊拉霉素不敏感的菌株，提取基因組DNA，以阿泊拉霉素的抗性基因引物Apr－F( 5'－GCTCATCGGTCAGCTTCTCA－3')和Apr－R( 5'－TCGCATTCTTCGCATCCC－3')進行PCR擴增．為進一步驗證該突變株，在所敲除基因序列的上下游設計檢測引物MTF( 5'－ACCACCTCATGGCGATCCCGTACAAC－3')和MTR( 5'－GCTGTGCGGTGAGTTCGTGCGGTT－3')，通過PCR結果判斷接合子的基因型(單交換或雙交換突變株)．

1. 2. 5壯觀鏈霉菌NRRL2494野生型菌株及其突變株的發酵和產物分析

NRRL2494野生型菌株或其突變株接種于SFM固體培養基上，28℃培養6 d后，刮取孢子接種于ZM液體培養基中，28℃、220 r/min搖床培養68～72 h．按照培養物∶培養基比例為1∶50的接種量轉接于新鮮的ZM液體培養基中，28℃、220 r/min繼續培養5 d，得到菌株的液體發酵物．發酵液經離心，調節上清pH至7．0，加等體積的乙酸乙酯提取2次，菌絲體經丙酮浸泡24 h，過濾、減壓濃縮至無丙酮水溶液，乙酸乙酯萃取2次．合并乙酸乙酯萃取液，用旋轉蒸發儀得到濃縮物樣品，溶于500 μL甲醇中，進行高效液相色譜( HPLC)檢測．檢測條件如下:流動相A為純水，流動相B為甲醇，流速為0．6 mL/min，檢測波長為254 nm．梯度洗脫程序: 0～6 min，20%～75%(體積分數，下同) B相; 7～10 min，75% B相; 11～15 min，75%～95% B 相; 16～20 min，95% B相; 21～22 min，95%～20% B相，23～37 min，20% B相．

2結果和分析

2. 1壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株的抗生素敏感性實驗

為了確定壯觀鏈霉菌遺傳操作系統所需的遺傳篩選標記，我們檢測了NRRL2494菌株對多種抗生素的敏感性．結果表明，NRRL2494菌株對卡那霉素、阿泊拉霉素和硫鏈絲菌素較敏感，而對氨芐青霉素、氯霉素、鏈霉素和萘啶酮酸都表現出不同程度的抗性(表1)．據此，我們以阿泊拉霉素作為NRRL2494突變株的篩選標記，并將萘啶酮酸作為接合轉移實驗中大腸桿菌的抑制劑．

2. 2壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株與大腸桿菌接合轉移實驗方法和條件的摸索

大腸桿菌與鏈霉菌的接合轉移方法由于條件溫和，操作方便和菌株穩定，是目前遺傳操作中最常用的方法［20］．鑒于壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株產生的孢子比較豐富，我們選擇利用該菌株的孢子，通過接合轉移的方法來探索其遺傳操作體系的建立．為收集大量孢子以進行遺傳操作，采用SFM、ISP2、ISP3、ISP4 和Waksman 5種固體培養基對NRRL2494菌株進行培養，發現其在SFM平板上的產孢情況最佳，故選用SFM培養基作為NRRL2494菌株的產孢培養基．由于鏈霉菌孢子的質量和數量是影響接合轉移成功與否的關鍵因素，我們采用插片法觀察NRRL2494菌株在SFM培養基上生長的菌絲和孢子的形態，并使用血球計數板對孢子進行計數，結果顯示:培養24 h后NRRL2494菌株開始產生少量孢子，48 h后開始產生色素，而96～120 h孢子形態和數量達到最佳狀態，168 h后孢子開始呈現老化狀態，故選取120 h作為孢子收集的時間．

表1壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株對不同抗生素的敏感性Tab．1　 The sensitivities of S．spectabilis NRRL2494 to various antibiotics

鑒于NRRL2494菌株較其他種屬鏈霉菌生長速度更快，我們在接合轉移實驗中設置了一系列供體菌與受體菌的接合時間梯度，由常規鏈霉菌使用的12～20 h縮短到6～14 h，發現結合時間在8 h左右效果最好．也正是基于該菌株生長速度快的特點，我們分別采用SFM完全培養基和半營養培養基進行接合轉移實驗，比較兩者差異發現，在抗生素覆蓋接合轉移平板后，完全培養基表面在48 h內就生長出菌苔，而半營養培養基上則在3～5 d后才出現分散的菌落．這一結果說明:完全培養基上鏈霉菌的生長速度過快，抑制了大腸桿菌的生長，導致接合轉移過程受阻;而半營養培養基限制了鏈霉菌的生長，保證了大腸桿菌的生長速率，使得大腸桿菌中的外源重組質粒能夠進入鏈霉菌，提高了接合效率．因此，我們選擇SFM半營養培養基作為NRRL2494菌株與大腸桿菌接合轉移的篩選培養基．

圖2 svaF基因失活突變株的構建及pWY5質粒驗證Fig．2 Construction of svaF inactive mutant and confirmation of plasmid pWY5

2. 3 svaF基因失活突變株的篩選

根據1．2．2小節中的方法，我們構建了用于NRRL2494菌株中酰胺合酶基因svaF敲除的重組質粒pWY5(圖2( a) )．為驗證其正確性，將pWY5以KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切，得到9．2和3．6 kb的兩個片段，用HindⅢ單酶切，得到12．8 kb的單個片段，結果均符合預期(圖2( b) )．

以大腸桿菌ET12567/pUZ8002/pWY5作為供體菌，壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株的孢子作為受體進行接合轉移，培養3～5 d后，在每個9 cm平板上都有20個以上的接合轉移子出現．挑取單菌落分別影印至含有硫鏈絲菌素和阿泊拉霉素的平板上培養，并對可能的單交換接合子在無抗性的固體培養基上進行2輪松弛，篩選出4個突變株，分別為SW1－2、SW1－3、SW1－10和SW1－12．以這4個突變株的基因組DNA為模板，用阿泊拉霉素抗性基因引物( Apr－F 和Apr－R)及檢測引物( MTF和MTR)分別進行PCR擴增．如果是雙交換菌株，可得到0．73 kb的阿泊拉霉素抗性基因片段和1．7 kb的檢測引物擴增產物;野生型菌株則只能得到1．0 kb的檢測引物擴增產物，而不含阿泊拉霉素抗性基因片段．PCR結果表明所得到的4個突變株均為雙交換菌株(圖3)，對檢測引物擴增產物的測序結果進一步驗證了突變株的正確性．

2. 4 svaF基因失活突變株的發酵產物分析

將所獲得的雙交換突變株進行發酵培養，同時以NRRL2494野生型菌株作為對照，用HPLC－質譜( MS)聯用的方法檢測發酵產物．結果顯示，野生型菌株的發酵產物(圖4( a) )在保留時間為31．29和37．60 min時，分別檢測到曲張鏈菌素組分C(［M+H］+( m/z: 769．8)，［M+Na］+( m/z: 791．8) ;圖4 ( c) )和組分G(［M+H］+( m/z: 786．4)，［M+Na］+( m/z: 808．3) ;圖4 ( d) )，而突變株發酵產物(圖4( b) )未檢出相應的組分，即突變株不再產生野生型菌株中主要的曲張鏈菌素組分C和G，說明位于重組質粒pWY5上的外源DNA通過接合轉移從大腸桿菌中導入到了壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株中，并發生了預期的同源重組，成功地獲得了酰胺合酶基因svaF缺失的雙交換突變株．酰胺合酶屬于NAT ( arylamine N－acetyltransferase)家族，具有保守的Cys－His－Asp三聯體活性位點，與聚酮鏈的釋放環化有關［21］．由于這些突變株不再產生曲張鏈菌素的組分，表明酰胺合酶與曲張鏈菌素的生物合成相關．

3討論

鏈霉菌屬于放線菌中的最大類群，是一類具有重要經濟價值的革蘭氏陽性菌，能夠產生多種抗生素和生物活性物質．為實現對其生物合成途徑及代謝調控的人工控制，需要穩定的遺傳操作系統．通過接合轉移的方式，鏈霉菌遺傳操作體系的發展相對成熟，但對壯觀鏈霉菌的遺傳操作系統仍未見報道．壯觀鏈霉菌能夠產生大觀霉素、曲張鏈菌素、硝本吡喃酮、巴弗洛霉素等多種抗生素［22］，其中曲張鏈菌素是一種極具前景的候選藥物．因此，建立壯觀鏈霉菌的遺傳操作體系，利用組合生物合成的方法對其改造，有望獲得具有良好活性的新型化合物．

圖3 svaF基因失活突變株PCR產物的凝膠電泳分析Fig．3 Gel electrophoresis analyses of PCR products from svaF inactive mutants

在常規的放線菌基因敲除實驗中，接合轉移過程中供體菌和受體菌的接合時間一般都在12 h以上，鮮見低于12 h的報道．我們按照常規鏈霉菌使用的接合時間12～20 h，多次嘗試壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株的接合轉移都沒能成功獲得接合子．插片法觀察的結果表明NRRL2494菌株的生長速度較普通鏈霉菌快，因此我們嘗試縮短接合時間至8 h，同時選擇半營養培養基用于接合轉移，最終成功建立了外源DNA通過接合轉移進入壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株的遺傳操作體系，并實現對其所產生曲張鏈菌素的生物合成基因進行體內敲除的遺傳操作，獲得了曲張鏈菌素酰胺合酶基因svaF失活的雙交換突變株，使該突變株不再產生曲張鏈菌素．此外，生物信息學分析表明，該基因與利福霉素生物合成基因簇中的rifF同源性較高;而RifF是利福霉素生物合成中的關鍵酶，負責安莎聚酮鏈的釋放［23］．我們的實驗結果暗示曲張鏈菌素中的酰胺合酶SvaF在體內可能具有與RifF相似的功能．

圖4 svaF基因失活突變株發酵產物的高效液相色譜－質譜分析Fig．4 Analyses of fermentation products from svaF inactive mutants by HPLC－MS

綜上所述，本研究成功建立了壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株的遺傳操作體系，為進一步研究曲張鏈菌素的生物合成和獲取曲張鏈菌素的新結構類似物奠定了基礎，同時也為其他生長速度較快的鏈霉菌屬菌種的相關研究提供了參考．

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Gene Manipulation System for Streptovaricin Producer Streptomyces spectabilis NRRL2494

SONG Jiaojiao1，KANG Qianjin2，ZHANG Lianru1，WU Yingying1，3*，BAI Linquan2

( 1．State－Province Joint Engineering Laboratory of Targeted Drugs from Natural Products，School of Life Sciences，Xiamen University，Xiamen 361102，China; 2．State Key Laboratory of Microbial Metabolism，School of Life Sciences and Biotechnology，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China; 3．Key Laboratory of Synthetic Biology，Institute of Plant Physiology and Ecology，Shanghai Institutes for Biological Sciences，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 200032，China)

Abstract:In order to enable the streptovaricin biosynthetic study by in vivo gene disruption，it is crucial to develop a genetic modification system for the streptovaricin producer Streptomyces spectabilis NRRL2494．In this study，we aimed to establish a method of conjugation to transfer exogenous DNA into Streptomyces spectabilis NRRL2494．A putative streptovaricin amide synthase gene svaF was disrupted in vitro，and the constructed plasmid was transferred into Streptomyces spectabilis NRRL2494 by conjugation through a double－crossover recombination event．The resulting svaF mutant lost the ability to produce streptovaricin．Based on the above work，we developed a genetic manipulation system for Streptomyces spectabilis NRRL2494，enabling the functional characterization of streptovaricin biosynthetic genes in vivo，and offering a positive example for other fast－growing Actinobacteria which lack an appropriate genetic manipulation system．

Key words:Streptomyces spectabilis; genetic manipulation system; streptovaricin; biosynthesis; amide synthase

*通信作者:wuyingying@ xmu．edu．cn

基金項目:國家自然科學基金( 31100027) ;高等學校博士學科點專項科研基金( 20110121120013)

收稿日期:2015－02－06錄用日期: 2015－04－20

doi:10．6043/j．issn．0438－0479．2016．01．011

中圖分類號:Q 933

文獻標志碼:A

文章編號:0438－0479( 2016) 01－0060－07

引文格式:宋姣姣，康前進，張連茹，等．曲張鏈菌素產生菌壯觀鏈霉菌NRRL2494菌株遺傳操作體系的建立［J］．廈門大學學報(自然科學版)，2016，55( 1) : 60－66．

Citation: SONG J J，KANG Q J，ZHANG L R，et al．Gene manipulation system for streptovaricin producer Streptomyces spectabilis NRRL2494［J］．Journal of Xiamen University( Natural Science)，2016，55( 1) : 60－66．( in Chinese)