AKT和HK2在口腔鱗狀細胞癌中的表達①

李善昌，吳　騫，丁元圣，孫　宇，閆　磊

(佳木斯大學附屬第二醫院口腔頜面外科,黑龍江 佳木斯 154002)

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AKT和HK2在口腔鱗狀細胞癌中的表達①

李善昌，吳騫，丁元圣，孫宇，閆磊

(佳木斯大學附屬第二醫院口腔頜面外科,黑龍江 佳木斯 154002)

摘要：目的： 探討AKT、HK2在口腔鱗癌及其癌旁組織中的表達情況，并對其表達水平與臨床特征之間的關系進行相關性分析，探討其與口腔鱗癌發生、發展和轉移的關系。方法：應用病例對比設計，采用免疫組化SP法對50例口腔鱗癌石蠟標本及20例癌旁正常組織中AKT、HK2蛋白的表達情況進行研究，使用SPSS21.0統計學軟件對實驗數據進行統計學處理，進而分析其與臨床病理特征的關系。結果： AKT,HK2在病例組中表達明顯高于對照組。AKT與HK2表達與細胞分化、臨床分期、淋巴結轉移及局部侵襲性相關，差異結果具有統計意義(P<0.05)。結論：AKT,HK2在口腔鱗癌中的表達上調，AKT與HK2蛋白表達呈正相關。

關鍵詞：口腔鱗癌；AKT；HK2；免疫組化

口腔鱗癌是頜面部最常見的惡性腫瘤。腫瘤標志物檢測對腫瘤細胞的早期診斷，淋巴結的轉移及預后生存分析有獨特作用[1,2]。在絕大多數惡性腫瘤細胞中，即使在氧氣充足的條件下，糖酵解代謝也異常活躍，對腫瘤細胞的增殖提供能量，稱為Warburg效應，目前這一效應已經成為了許多惡性腫瘤的顯著特征[3]。糖酵解過程中的關鍵因子葡萄糖轉運體(glucose transporter,GLUT)、己糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)、乳酸脫氫酶(lactate dehygrogenase,LDH)等在許多癌細胞中呈高表達，其中HK在口腔癌中的研究還比較少。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-AKT 即蛋白激酶 B(protein kinase B,PKB)通路，也就是PI3K-AKT通路，參與了糖酵解酶HK的上游調控，所以HK2與AKT在糖酵解過程中扮演重要角色，二者與腫瘤關系密切。

1材料和方法

1.1材料

選取在佳木斯大學附屬第二醫院口腔醫院收治的口腔鱗癌患者50例，其中男34例，女16例，年齡≤60歲22例，年齡>60歲28例。所有患者均有完整的臨床病理資料且術前均未經過放化療。采用TNM 分類標準進行臨床分期，其中Ⅰ~Ⅱ期31例、Ⅲ~Ⅳ期19例；病理分級，分為高分化30例，中~低分化20例；經病理檢查證實有頸部淋巴結轉移的29例，未轉移的21例；另外選擇20例癌旁正常組織作為對照組。癌旁組織取自距癌組織>1cm處。所有病理標本經HE染色后由兩位高年資病理科醫生復診，均證實為口腔鱗狀細胞癌。

1.2實驗試劑

小鼠抗人HK2多克隆抗體，兔抗人AKT多克隆抗體，試劑盒(SP-9000)，DAB 試劑盒。

1.3免疫組化檢測

全部組織樣本均行常規固定, 包埋, 連續切片, 抗原修復, SP法染色。選擇用試劑公司提供的已知高表達陽性切片在同一條件下作為陽性參照, 選擇PBS替代一抗作為陰性參照。免疫組化染色步驟按試劑盒的說明進行染色。

1.4結果判定

AKT,HK2陽性表達為棕黃色或棕色團塊。采用雙盲法讀片,隨機在顯微鏡下選取5個100視野，每個視野下細胞數不少于100個,計數腫瘤細胞中陽性個數百分率：陽性細胞數<10%記為(-)；陽性細胞數在10%及以上的均記為(+)。

1.5統計學方法

采用 SPSS21.0統計軟件分析所有實驗數據均，蛋白陽性表達情況與其它臨床病理參數的相關性采用χ2檢驗分析，AKT與HK2兩種蛋白之間表達的關系應用Spearman等級相關分析檢測，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1AKT在口腔鱗癌組織及癌旁組織中的表達

AKT在腫瘤細胞中陽性染色主要定位在胞漿，為棕黃色或棕色團塊。在口腔鱗癌組中陽性表達率為72%,見圖1。在正常口腔黏膜組中陽性表達率為40%。兩組間結果不同，有意義 (P<0.05)，見表1。

圖1　AKT在口腔鱗癌中的表達(×200)

2.2AKT的表達與臨床病理的關系

高分化者陽性率為55%(11/20)，中、低分化者陽性率約為83.3%(25/30)，(P<0.05)。TNM分期中，I-II期陽性表達率約為61.2%(19/31)，III-IV期陽性表達率為89.4%(17/19), (P<0.05)。有淋巴結轉移組陽性表達率約為82.7%(24/29)，無淋巴結轉移組陽性表達率約為57.1%(12/21), (P<0.05),有局部侵襲性組陽性表達率約為83.3%(25/30),無局部侵襲性組陽性表達率約為55%(11/20)，(P<0.05)，見表2。

2.3HK2在口腔鱗癌組織及癌旁組織中的表達

HK2在腫瘤細胞中陽性染色主要定位在胞漿，為棕黃色或棕色團塊。在口腔鱗癌組中陽性表達率為66%，見圖1。在正常口腔黏膜組中陽性表達率為35%。兩組間結果不同，有意義(P<0.05),見表1。

2.4HK2的表達與臨床病理的關系

高分化者陽性率為45%(9/20)，中、低分化者陽性率約為80%(24/30)，(P<0.05)。TNM分期中，I-II期陽性表達率約為54.8%(17/31)，III-IV期陽性表達率為84.2%(16/19), (P<0.05)。有淋巴結轉移組陽性表達率約為82.7%(24/29)，無淋巴結轉移組陽性表達率約為42.8%(9/21), (P<0.05) 有局部侵襲性組陽性表達率約為80%(24/30),無局部侵襲性組陽性表達率約為45%(9/20)，(P<0.05)，見表2。

2.5口腔鱗癌組織中AKT蛋白與HK2蛋白的相關性

統計本實驗數據，AKT蛋白與HK2蛋白在50例口腔鱗癌組織中同時表達陽性28例，同時表達陰性9例，經 Spearman 秩相關性分析，二者呈正相關關系(P=0.004,r=0.399),見表3。

表2　AKT和HK2表達與口腔鱗癌臨床病理的關系

圖2　HK2在口腔鱗癌中的表達(×200)

HK2AKT+-rP+2850.399<0.05-89

3討論

AKT蛋白是一種絲/蘇氨酸激酶,是細胞內病毒原癌蛋白一的同族體[4]，它在PI3K-AKT信號轉導通路中處于核心地位, 參與細胞的周期性調節、生長代謝、增殖、凋亡等多種生物學活性，此蛋白的異常表達是造成腫瘤細胞發生、發展的關鍵[5]。哺乳動物基因組包括3種 AKT 基因，編碼 AKT1(PKBα)、 AKT2(PKBβ) 、AKT3(PKBγ) 異構體，同源性達80%以上[6]。其中，糖酵解代謝過程中的關鍵酶HK就是AKT控制的下游分子之一，兩者在促進細胞分裂增殖和抑制凋亡中起到關鍵作用。有相關文獻報道AKT還可以維持HK的高活性，提示說明兩者可能在癌癥發展過程中有協同作用，這與本實驗中AKT與HK2在50例口腔鱗癌中的表達情況經Spearman相關性分析認為二者呈顯著性正相關的研究結果相一致。并且AKT的陽性表達率與組織學類型、細胞分化程度、臨床分期,局部侵襲性及淋巴結轉移有關。

HK2在許多生長迅速的惡性腫瘤細胞中均呈現高表達[7]，例如乳腺癌、肺癌、宮頸癌[8~10]等。HK家族分四個亞型，分別是HK1,HK2,HK3,HK4,但只有HK2對葡萄糖最具親和力并且其催化能力最強。它是糖酵解化學反應過程中第一個最關鍵的重要酶，將所有進入細胞內的葡萄糖完全催化反應成為6-磷酸葡萄糖，在通過糖酵解途徑產生大量能量和中間代謝產物以滿足腫瘤細胞分裂增殖的需求。同時有研究表明,AKT可以促進HK2與線粒體的結合，腫瘤細胞內的HK2黏附在線粒體外膜(OMM)上,并與線粒體外膜通道蛋白VDAC1發生結合,從而發揮其抑制凋亡效應。其次，本實驗結果發現口腔鱗癌無淋巴結轉移組中HK2蛋白陽性率顯著低于淋巴結轉移組，且HK2的陽性表達隨著病理分級的降低、臨床分期的增高而明顯增強，提示HK2蛋白表達上調在口腔鱗癌的發生、發展、浸潤及轉移過程中可能起一定作用，這與許多國內外學者的研究相似。

綜上所述， AKT和HK2蛋白均可能成為檢測口腔鱗癌的重要指標，并且為惡性腫瘤的靶向治療提供一種可能。

參考文獻：

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The expression and significance of AKT and HK2 proteins in oral squamous cell carcinoma

LIShan-chang,WUQian，DINGYuan-sheng，SUNYu，YANLei

(The Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Stomatological Hospital, Jiamusi University, Jiamusi 154002，China)

Abstract:Objective: To examine the expression and clinical and pathological significance of PTEN and PI3K in oral squamous cell carcinoma(OSCC). Methods: The Expression levels of PTEN, PI3K protein were determined by using immunohistochemistry SP in 52 cases of OSCC and 20 specimens of normal oral mucosa tissues. The correlation between PTEN and PI3K protein and between the two markers and clinical and pathological parameters were analyzed. Results: AKT, HK2 expression was significantly higher in the patient group. AKT and HK2 expression was related with cell differentiation, clinical stage, lymph node metastasis and local invasiveness. The difference was statistically significant. Conclusion:AKT, HK2 expression in oral squamous cell carcinoma. AKT was positively correlated with protein expression of HK2.

Key words:oral squamous cell carcinoma;AKT;HK2

(收稿日期：2015-09-18)

中圖分類號：R739.85

文獻標識碼:A

文章編號：1008-0104(2016)01-0019-03

作者簡介:李善昌(1969～)男，黑龍江佳木斯人，學士，主任醫師，教授，碩士研究生導師。通訊作者:吳騫(1991～)男，遼寧沈陽人，在讀碩士研究生。E-mail:1755372155@qq.com。

基金項目：黑龍江省教育廳科研項目，編號：12521553。