南極冰藻對南極極端環境的適應性研究進展

王以斌張愛軍劉芳明鄭洲繆錦來

（1. 國家海洋局第一海洋研究所，青島 266061；2. 青島海洋科學與技術國家實驗室，青島 266235）

南極冰藻對南極極端環境的適應性研究進展

王以斌1，2張愛軍1劉芳明1，2鄭洲1，2繆錦來1，2

（1. 國家海洋局第一海洋研究所，青島 266061；2. 青島海洋科學與技術國家實驗室，青島 266235）

南極冰藻是生存在南極海水、海冰及冰川融水等環境中各類微藻的總稱，是南極海冰-海水生態系統中重要的生態群體和主要的初級生產力來源。南極冰藻有特殊的適應機制來響應南極地區低溫、季節性光照、強紫外輻射和高鹽度等極端環境，其環境適應性機制的研究是各國科學家研究的熱點。綜述了南極冰藻的低溫、光照和強紫外輻射適應性及其抗逆基因研究等方面的最新進展，以期從多方面闡述和揭示南極冰藻的極端環境適應機制，使人們能更清晰的了解南極微藻在整個地球化學循環過程中的作用。

南極冰藻；極端環境適應機制；低溫適應性；紫外輻射；基因調控與響應

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.015

南極是地球上最冷的區域之一，低溫是極地生態環境最基本的特征，海水和海冰的溫度常年在0℃以下，海冰的溫度甚至可以低至-50℃［1］。此外，還有季節性的光照、臭氧空洞造成的強紫外輻射以及海水-海冰反復凍融造成的鹽度大幅度變化等特點［2］。南極冰藻是生存在南極海水、海冰及冰川融水等極端環境中各類微藻的總稱［3］，是南極生態系統中重要的生態群體和食物鏈的關鍵組成部分［4］，也是夏季南大洋海冰-海水生態系統中主要的初級生產力來源［5］，冰藻對南極海冰區初級生產力的直接貢獻率超過20%［6］。

低溫、季節性光照和強紫外輻射是南極地區最顯著的環境特點，冰藻對南極極端環境適應性機制的研究主要集中在這些方面，冰藻需要有特殊的適應機制來響應比其他地區更惡劣和劇烈變化的南極環境。20世紀90年代以后，隨著南極地區生態學研究計劃的進行，各國科學家對冰藻的生理生化特性以及環境適應性機制等方面開展了大量的研究工作。目前，南極冰藻中小球藻（Chlorella sp.）、衣藻（Chlamydomonas sp.）和角毛藻（Chaetoceros sp.）等種屬的環境適應性機制已有廣泛和深入的研究［4］。近年來隨著現代分子技術的日益成熟，其環境適應性機制的研究逐漸深入到基因和分子水平。基因組學、轉錄組學、蛋白組學和代謝組學的研究以及新基因和新的代謝途徑等的發現，有助于人們揭示和闡述南極冰藻的極端環境適應機制。本文綜述了當前在南極冰藻的低溫、光照和強紫外輻射適應性及其抗逆基因研究等方面的最新進展。以期從多方面闡述和揭示南極冰藻的極端環境適應機制，使人們能更清晰的了解南極微藻在整個地球化學循環過程中的作用。

1　南極冰藻對低溫的適應性

低溫適應性是南極冰藻最基本的適應性特征。冰藻對溫度逆境的適應主要在于其生物膜系統的穩定性，這是其胞內細胞膜的流動性機制、細胞膜不飽和脂肪酸的變化機制、抗凍蛋白及冰活性物質、低溫酶的作用機制等共同作用的結果。在極地環境中，不同脂肪酸組分的積累在生物的生存策略中發揮了極其重要的作用［4］。極地的低溫環境顯著地影響到脂肪的代謝，脂肪酸的不飽和化是冰藻低溫適應的重要策略［4］。冰藻通過增加細胞膜磷脂脂肪酸的不飽和度、降低碳鏈長度和增加支鏈脂肪酸的含量等方式，保持細胞膜的最佳流動性，從而維持細胞在低溫下的正常生理功能。因此，膜系統和脂肪酸的研究是南極冰藻低溫適應性研究的熱點。

Tonon等［7］在南極小球藻Chlorella sp.中的研究發現，隨著溫度的降低，Δ12脂肪酸（16∶2、 16∶3、18∶2、18∶3）的總量升高；而在舟形藻Navicula sp.中隨著溫度的升高20∶5不飽和脂肪酸含量降低［8］。Hu等［9］發現南極小球藻Chlorella vulgaris的抗凍能力與其胞內的C18∶3脂肪酸含量相關。4℃和15℃條件下，南極小球藻Chlorella vulgaris NJ-7中Δ12去飽和酶基因的表達量分別是25℃時的4.9倍和3.2倍，說明低溫下NJ-7胞內不飽和脂肪酸的含量明顯增加［10］。最適生長溫度條件下，同種屬極地微藻中的長鏈多不飽和脂肪酸EPA和DHA的產出效率高于該種屬的溫帶微藻［11］。Teoh等［12］研究了分別來自南極、溫帶和熱帶海洋的衣藻、小球藻和舟形藻的溫度適應性發現，只有南極衣藻C. UMACC 229在4-20℃時能顯著產生多不飽和脂肪酸（PUFA），并且PUFA中十六碳三烯酸（16∶3）占到總脂肪酸含量的約50%（48.4%-57.2%），PUFA總量占總脂肪酸的65.7%-76.5%。在南極舟形藻N. glaciei UMACC 231中，4-20℃時單不飽和脂肪酸（MUFA）占總脂肪酸比值較大（28.4%-59.3%），且主要是十六碳烯酸（25.4%-56.3%），PUFA所占比例只有11.6%-30.9%；而在南極小球藻C. UMACC 237中，飽和脂肪酸占67.2%-84.2%［12］。這些研究結果說明環境溫度對脂肪酸的影響顯著，不同種屬南極微藻中脂肪酸的組成和含量對溫度變化的響應結果不同，顯然，各種南極微藻中脂肪酸對低溫環境的適應性策略和機制是明顯差異的。

南極微藻對低溫的適應不僅是增加細胞膜磷脂中不飽和脂肪酸的含量，也許更重要的是在葉綠體膜組成中增加半乳糖脂的含量［13］，這一研究結論在南極衣藻Chlamydomonas sp. ICE-L中同樣獲得了證實。在-20℃低溫處理后，C. ICE-L類囊體膜中的單半乳糖脂和雙半乳糖脂的含量均明顯增加，同時類囊體膜脂肪酸的不飽和度隨低溫脅迫時間的延長而增大，其中十八碳-9，12，15-三烯酸（18∶3ω9）的含量增加明顯［14］。低溫和弱光脅迫過程中，完整PS I復合物、ATP合成酶、細胞色素b6f和RuBP羧化酶能夠保持穩定；同時，葉綠體中葉綠素a與類囊體膜中單半乳糖脂、十六烷酸和十八碳-9，12-二烯酸的變化存在一致趨勢，表明C. ICE-L的類囊體膜在低溫下的穩定性和弱光環境中完成光合作用是細胞內色素、類脂、脂肪酸和色素蛋白復合物等相互協調作用的結果［14］。C. ICE-L在低溫、高鹽和缺氮的條件下胞內會大量積累脂肪顆粒，這可能是其在應對南極低溫和漫長的極夜等惡劣的環境過程中形成的自我保護機制［15］。

冰結合蛋白（Ice-binding protein，IBP）或者稱作抗凍蛋白（Antifreeze protein，AFP），在南極冰藻的低溫適應性機制中具有抑制冰晶凝結和防凍液的作用［16，17］，同時還可以在一定程度上改變冰晶的結構，構造適合冰藻生存的環境［18］。低溫脅迫時，南極角毛藻Chaetoceros neogracile的冰結合蛋白可以將細胞周邊冰晶的形狀由圓盤形改變為細長的六角形［19］。南極衣藻C. raudensis UWO 241培養液中上清液在1℃時具有明顯的冰結合蛋白活性，通過轉錄從中獲得了冰結合蛋白基因序列，而在溫帶衣藻中則未發現該蛋白基因序列［20］。南極淡水擬衣藻Chloromonas sp.的冰結合蛋白基因表達量在溫度下降時增加，而在溫度升高時降低；其蛋白三級結構預測顯示該蛋白是右手β螺旋結構，模型預測顯示β-2面是IBP蛋白與冰的結合區域［21］。

蛋白酶抑制分析表明，南極和中溫藍藻Synechocystis salina分別使用不同的蛋白酶類響應溫度和UV-B輻射的脅迫，在小球藻Chlorella vulgaris中也是相似的［22］。在中溫藍藻S. salina和C. vulgaris中，蛋白酶的數量和質量對溫度和UV-B變化的響應更敏感［22］，這可能是極地藻已經適應了低溫和強輻射的環境，因此所產生的應激響應不明顯。

除了脂肪酸、冰結合蛋白、低溫酶等在冰藻低溫適應機制中發揮主要的作用外，胞內的氨基酸和多糖類等也有助于降低細胞內的冰點以及維持酶的低溫下穩定催化活性［4］，如C. ICE-L中的脯氨酸和可溶性糖在其低溫適應的過程中發揮了一定作用［23］，Lyon等［24］對極地硅藻蛋白組學的研究也表明低溫下7種蛋白含量的增加與其胞內的脯氨酸合成有直接關系。

2　南極冰藻對季節性光照和強紫外輻射的適應性

南極大陸邊緣每年有近4個月的時間處于極夜，這段時間內冰藻會完全生活在黑暗中，研究顯示冰藻對黑暗的最長耐受時間可達9個月［4］，而當溫度和光照恢復后，它們又會迅速的恢復增長甚至形成藻華［25］。南極冰藻的生長對于低溫和黑暗具有自我保護，低溫和黑暗會抑制冰藻的生長。在抑制期內，南極衣藻Chlamydomonas sp.細胞內環境保持穩定；當溫度升高（由-4℃升高到4℃）時，其生長速度則明顯加快［26］。不同冰藻的捕光天線結構的不同引起對光能的利用機制和效率不同，從而造成了其生存環境的差異，如南極硅藻F. cylindrus可以利用非光化學淬滅和葉黃素循環來調整光能量的分配，其光系統結構適于海冰的有限光環境中吸收更多的光能量，從而最大限度的進行光合作用，但其卻不能生存在海水中；另一種硅藻P. subcurvata則只能生活在有穩定光照的淺水環境中；角毛藻Chaetoceros sp.的光系統能力介于二者之間，在大洋和海冰中均能生存［27］。當光照的強度超過正常輻照強度時（＞10倍），南極衣藻C. raudensis UWO241可以通過增加細胞的生長率來抵消光照幅度增加的影響，而不是表現出光的生長抑制；而南極小球藻Chlorella sp. BI則是通過調整細胞內光系統PS I和PS II的動態平衡來調整光吸收能力從而維持最佳的光合作用狀態［4］。

南極臭氧層破壞所帶來的強紫外輻射對微藻等單細胞生物有致命性的危害［28］。南極微藻首先可借助南極大量的雪和冰層屏蔽UV-B輻射，但當冰雪層融化后，浮游植物最容易受到UV-B的損傷［2］，UV-B增強導致浮游植物固定CO2減少，增強了溫室效應［29］；高能量的UV-B輻射不僅直接傷害生物細胞中的蛋白質、色素、脂類和DNA等［30］，而且產生超氧自由基和形成嘧啶二聚體，超氧自由基會導致DNA鏈的斷裂，而嘧啶二聚體能阻礙DNA的復制和轉錄，阻止遺傳信息傳遞，大大降低微生物的生長和繁殖速度［31］。但南極衣藻C. ICE-L中的實驗結果顯示，UV-B輻射的影響并非如預測的顯著。本課題組的研究成果已初步證實南極衣藻C. ICE-L中CPD光修復酶對DNA紫外線輻射損傷的修復功能［32］，所獲得光修復酶基因在大腸桿菌體內驗證表達具有光修復酶活性，體外檢測表明該光修復酶對紫外輻射所形成嘧啶二聚體的修復率達91.52%［33］。

Rautenberger等［34］研究了7種南極海冰微藻（4種褐藻、3種紅藻）對低溫和紫外輻射的耐受力，包括潛在光化學反應能力（Fv/Fm）、清除自由基能力等。2℃時3種紅藻對紫外輻射非常敏感，Fv/Fm下降非常明顯，而在7℃時Fv/Fm的變化卻不明顯，說明在7℃時UV耐受力明顯增加［34］。溫度升高后時7種冰藻對UV的耐受度均不同程度增強，是由于溫度升高后細胞自身活力增強，其自身的光損傷修復能力也隨之增強，使得對UV的損傷修復和耐受度增加，說明細胞的紫外輻射耐受度是受到溫度影響的，同時也證明了冰藻中光損傷修復機制的重要作用。在A. mirabilis中，UV增強引起胞內可溶性多酚清除自由基能力的增加，能夠大幅度提高其對UV的耐受度；而在H. grandifolius中，7℃時UV對細胞的損傷影響則被自身修復作用完全抵消了［34］。在南極大型藻褐藻L. nigrescens和D. antarctica中，強光照下15℃時胞內可溶性物質的抗氧化活性與多酚含量是與紫外輻射的強度是正相關的，而在弱光下15℃處理6 h后，Fv/Fm增加同時脂類過氧化保護作用降低，說明其在弱光下保留了自身的光保護和修復能力［35］。同樣，南極潮下帶的大型褐藻D. anceps在上層潮區是通過增加超氧化物歧化酶活性來提高光合系統的氧應激能力并保護光系統以抵御強光輻射帶來的損傷，同時，胞內多酚的含量增加也增強了對UV的耐受力；而在潮下帶的下層區，光線透過率低，D. anceps則需要調整光捕獲能力來增強弱光環境下的光合作用［36］。Huovinen等［37，38］的研究結果也顯示，隨著水深的不同和輻照光強的差異，大型藻對光的利用機制和紫外輻射損傷的修復機制是不同的。這說明南極大型藻中UV的耐受力和光系統自我保護機制也是因環境而變的，同一物種在應對環境脅迫時，環境因子的脅迫量不同其適應機制也是不同的，這與南極冰藻中的研究結論一致。

冰藻細胞中存在的強大抗氧化系統是其抵御南極環境中強紫外輻射和高活性氧的保障，其胞內存在大量能消除自由基的物質，如谷胱甘肽系統、過氧化物酶、超氧化物歧化酶等通過氧化還原反應消除氧自由基［4，39，40］。南極硅藻Chaetoceros brevis中，隨著輻射強度的增強，胞內葉黃素循環增加，同時超氧化物歧化酶活性增強，以消除輻照增強所帶來的氧自由基增加，保護細胞免受氧化損傷［41］。南極硅藻Chaetoceros neogracile中存在著抗壞血酸還原酶、谷氧還原蛋白、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽巰基轉移酶和交替氧化酶等多種抗氧化酶，極地冰藻中細胞免受氧化損傷的結果是多種抗氧化酶共同作用所產生的［42］。多不飽和脂肪酸在冰藻的低溫適應性機制中作用非常重要，同時其非常易于氧化，谷胱甘肽巰基轉移酶可以與親電中心結合成絡合物以保護多不飽和脂肪酸免受過氧化氫等氧化反應的氧化［4］。谷胱甘肽系統的上述作用已經在南極衣藻Chlamydomonas sp. ICE-L［43］和硅藻Fragilariopsis cylindrus［24］中得到了證實。

3　南極冰藻的抗逆基因研究

南極冰藻環境適應性機制的研究已進入基因組學水平。極地冰藻的基因組可提供給人們很多關于冰凍圈內以前未知的基因、蛋白和代謝途徑等有價值的信息［4］。南極單細胞綠藻Coccomyxa subellipsoidea C-169是第一個完成全部基因組測序的極地真核微生物［44］，其基因組中包括了脂肪酸合成酶、去飽和酶及酯酶等大量的脂肪酸酶家族基因，而細胞膜脂肪酸的不飽和化是冰藻對低溫脅迫的重要響應機制［4］。相對于同種屬的溫帶微藻，C-169的基因能合成更多的氨基酸轉移酶和跨膜轉運蛋白，以促進細胞營養元素的吸收和富集［44］。此外，極地硅藻Fragilariopsis cylindrus的全基因組測序也已完成并公開［45］，在其經過鑒定的56個蛋白中發現有3個是以前未知的［4，24］。Raymond等［46］在南極雪藻擬衣藻Chloromonas sp. CCMP681中發現包括抗凍蛋白在內的多條有價值的功能基因。此后，通過轉錄獲得了南極衣藻C. raudensis UWO 241的冰結合蛋白基因，并最終通過異源表達和純化驗證獲得了高純度的冰結合蛋白［20］。南極角毛藻Chaetoceros neogracile的冰結合蛋白基因中開放閱讀框長度為849 bp和282個氨基酸，蛋白分子量是29.2 kD［19］。南極擬衣藻Chloromonas sp.中冰結合蛋白基因長度為3.2 kb，含有12個外顯子，其蛋白的分子量是34.0 kD［21］。

不同生態環境中存在的同一物種或種屬生物的基因差異和環境適應變化的比較對生物環境適應性的研究更具有價值，目前也已有學者開始了這方面的研究［12，47］。廣泛分布于世界各地海洋和淡水，包括高山冰川中的衣藻（Chlamydomonas sp.）便是這樣一種重要的模式藻種［16］。淡水中有著名的萊茵衣藻（C. reinhardtii）［16］，在南極地區有C. raudensis UWO241［48］和C. ICE-L［14，15］，北極海冰中有C. ARC［49］，此外還有高山冰雪中的C. nivalis［50］等。

基因表達的變化是南極冰藻適應極端環境的重要響應［51］。Chong等［51］從南極小球藻Chlorella UMACC 234中篩選出22個響應溫度脅迫（4℃、20℃和30℃）的差異基因并研究了其表達情況，這些基因主要與細胞的維持、光合系統、電子轉移和碳水化合物的代謝相關聯，其中葉綠體蛋白PSIICP47在4℃時的表達量是20℃時（最適生長溫度）的3倍［51］。南極衣藻Chlamydomonas sp. ICE-L中，Liu等［52］克隆得到編碼651個氨基酸的熱激蛋白Hsp 70的基因全長序列；Zhang等［53］克隆得到編碼434個氨基酸的ω-3脂肪酸脫氫酶的基因全長序列，基因表達分析發現熱激蛋白Hsp 70和ω-3脂肪酸脫氫酶均能夠應答低溫和高鹽度的脅迫［52，53］。

本課題組近期在南極冰藻基因組學及逆境脅迫相關基因和蛋白的功能驗證、轉錄組測序、基因和蛋白表達調控分析等方面開展大量工作［15，32，54，55］，已完成南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L中轉錄組的測序及分析。對C. ICE-L中與光捕獲和光防護相關的集光復合體（Light harvesting complex，LHCs）的研究發現該復合體能夠應答光照和鹽度的脅迫［15］；在強光、高鹽和紫外脅迫條件下，Fv/Fm降低，而Lhc SR1和Lhc SR2的基因表達量均有大幅度升高，同時有較高水平的非光化學淬滅，兩者呈正相關性，Lhc基因在降低過剩光能防止光氧化對光合系統的破壞中起重要作用［15］。克隆了C. ICE-L不飽和脂肪酸合成途徑中的Δ12、Δ9、Δ6和ω3等幾個關鍵基因，研究了溫度在轉錄水平上對C. ICE-L脂肪酸去飽和酶的調節作用和機制，并在聚球藻Synechococcus 6803中對Δ12CiFAD去飽和酶基因的功能進行了體外表達驗證［54］。分析了鹽脅迫下脂肪酸去飽和酶基因的表達，Δ12CiFAD、ω3CiFAD2和Δ6CiFAD基因在應對長時間鹽脅迫時具有保護細胞的作用，而ω3CiFAD1基因對高鹽度的響應更加敏感［55］。這些結果表明溫度和鹽度等環境因素可以通過影響脂肪酸去飽和酶的基因表達及其活性的調控，使C. ICE-L細胞得以迅速改變脂肪酸的組成來適應環境的變化。已獲得C. ICE-L中編碼579個氨基酸的光修復酶PHR2基因，其與萊茵衣藻中PHR2基因的同源性為68%；通過構建C. ICE-L中光修復酶PHR2基因的原核表達載體，驗證了其光修復活性，證實了光修復酶對DNA紫外線輻射損傷的修復功能［32］，以上在南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L中的基因和蛋白表達調控的研究為明確南極冰藻適應低溫、強輻射以及鹽度環境的分子機理奠定了堅實基礎。

4　結語

過去的10年間，基因組、轉錄組、蛋白組學、代謝組學等分子生物學工具和研究手段更多的應用于極地冰藻環境適應性機制的研究中，并取得了巨大的成就。新發現的基因和代謝途徑不僅有助于人們更深入的揭示和闡述南極冰藻的極端環境適應機制，而且會對低溫酶、嗜冷基因等在生物技術的應用產生深遠影響，同時有助于人們更加清晰地了解極地微藻在整個地球生物化學循環過程中的作用。

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（責任編輯 馬鑫）

Advances in Studies on the Acclimation of Antarctic Ice Microalgae to Extreme Environments

WANG Yi-bin1，2ZHANG Ai-jun1LIU Fang-ming1，2ZHENG Zhou1，2MIAO Jin-lai1，2
（1. First Institute of Oceanography，State Oceanic Administration，Qingdao 266061；2. Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology，Qingdao 266235）

Antarctic ice microalgae are the phytoplankton or microalgae that thriving in the pelagic，ice and meltwater environments of the Antarctic，which are the main sources of primary production in an otherwise barren region. Antarctic microalgae possess unique adaptations that allow them to proliferate in extreme conditions characterized by low or freezing temperature，seasonal light，strong ultraviolet radiation and high salinity fluctuations. Thus，understanding the underlying mechanisms of their acclimation has gained strong interests in the past years. This paper then aims to provide a succinct review on the progress，status and new paradigms of research on Antarctic microalgae. These new findings on Antarctic ice microalgae will help us gain deeper insights into the general adaptive mechanisms of all phytoplankton to extreme environment and the potential role of these organisms in the important biogeochemical cycles.

antarctic ice microalgae；extreme environment adaptive mechanisms；cold-adaptability；UV-radiation；gene regulation and response

2016-07-13

國家自然科學基金委員會-山東省人民政府海洋科學研究中心聯合資助項目（U1406402），國家自然科學基金項目（41576187），中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金項目（2015G10），中國極地科學戰略研究基金項目（20150303），國家海洋公益性行業科研專項項目（201405015），青島市創業創新領軍人才計劃項目（15-10-3-15-（44）-zch），青島海洋科學與技術國家實驗室鰲山科技創新計劃項目（2015ASKJ02）

王以斌，男，助理研究員，研究方向：極地海洋生物學；E-mail：wangyibin@fio.org.cn

繆錦來，男，研究員，研究方向：極地海洋生物學；E-mail：miaojinlai@fio.org.cn