海州香薷不同抗性種群液泡轉化酶基因EhvINV序列趨異及表達差異分析

蔡深文徐仲瑞熊治廷，3王加真陳瑤

（1. 遵義師范學院資源與環境學院，遵義 563002；2. 武漢大學資源與環境科學學院，武漢 430079；3. 生物質資源化學與環境生物技術湖北省重點實驗室，武漢 430079；4. 遵義師范學院生命科學學院，遵義 563002）

海州香薷不同抗性種群液泡轉化酶基因EhvINV序列趨異及表達差異分析

蔡深文1，3徐仲瑞2熊治廷2，3王加真4陳瑤4

（1. 遵義師范學院資源與環境學院，遵義 563002；2. 武漢大學資源與環境科學學院，武漢 430079；3. 生物質資源化學與環境生物技術湖北省重點實驗室，武漢 430079；4. 遵義師范學院生命科學學院，遵義 563002）

根據GenBank中海州香薷（Elsholtzia haichowensis）液泡轉化酶基因EhNvINV（JX500755）和EhCvINV（JX500756）的序列設計特異性引物，克隆cDNA全長序列，并通過生物信息學分析基因及推導的蛋白序列，利用SWISS-MODEL進行同源建模，并與蔗糖分子進行模擬對接，實時熒光定量PCR分析EhNvINV和EhCvINV在銅脅迫下的轉錄表達。結果表明，海州香薷非抗性和抗性種群液泡轉化酶蛋白EhNvINV和EhCvINV在114和346處存在氨基酸趨異位點，模擬3D結構相似，僅在趨異位點Glu114/ Gln114和Leu346/Pro346處有差別。EhNvINV、EhCvINV和模擬突變體（EhNvINV-E114Q和EhNvINV-L346P）與蔗糖分子對接形成的活性中心構象基本一致，但在空間位置上存在細微差異。實時熒光定量PCR結果表明銅脅迫7 d后，EhCvINV的表達受銅的誘導，而EhNvINV受銅的抑制。

海州香薷；液泡轉化酶；銅脅迫；轉錄表達

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.021

生長在重金屬污染土壤中的植物，其生長受重金屬的脅迫，為了維持正常生長代謝和重金屬抗性機制，必須獲得足夠的碳源和能量。在大多數高等植物中，產自葉的光合同化物以蔗糖的形式經韌皮部轉運到各個庫器官中［1］。庫器官對韌皮部蔗糖的卸載和利用促進蔗糖向庫器官流動，因此庫器官中與蔗糖卸載和利用相關的酶對調控同化物分配具有關鍵作用［2］，然而蔗糖必須通過蔗糖合酶或轉化酶水解為己糖才能被植物生長代謝所利用。液泡轉化酶（vacuolar invertase，vINV），也稱作可溶性酸性轉化酶，最適pH為酸性（pH5.0-5.5），在水解蔗糖和應對環境脅迫等方面具有重要的作用［3］，研究表明液泡轉化酶參與低溫、低氧、水分脅迫等環境逆境的調控過程［4］。重金屬作為一種重要的環境脅迫因子，往往影響植物的生長，但關于液泡轉化酶與重金屬脅迫之間的關系報道較少。

大多數植物在高濃度銅含量的土壤中無法生長和繁殖，但某些植物在長期的脅迫環境下進化出銅抗性機制，能夠在銅礦區或銅污染的土壤中生存，海州香薷（Elsholtzia haichowensis）便是其中的代表性植物［5］。海州香薷在非礦區也有分布，但礦區種群比非礦區種群具有更高的銅抗性，這可能是由于銅礦區的海州香薷長期生活在高濃度銅污染的環境下，發生了與銅污染相適應的抗性進化，形成了與非礦區種群不同的抗性生態型。海州香薷已逐漸成為研究植物銅吸收、耐性與解毒機理的模式植物，但其基因信息還較少報道，前期研究表明海州香薷兩個不同抗性種群的液泡轉化酶活性在銅脅迫下存在差異［6］，而酶活性通常與基因及其表達調控過程相關，因此研究海州香薷不同抗性種群液泡轉化酶基因編碼的蛋白信息及在銅脅迫下的轉錄表達，對于進一步深入研究銅脅迫下不同抗性種群酶活性差異的分子機制具有重要的參考意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料 海州香薷（E. haichowensis）種子分別采自湖北大冶銅綠山古銅礦遺址（抗性種群）和湖北紅安（非抗性種群）。水培14 d后剪取新鮮的根尖（約2 cm）用于RNA提取，水培及銅處理均在人工培養室內進行，光周期14 h光照、10 h黑暗，光照強度122 μmol·m-2s-1，溫度控制25/15℃。

1.1.2試劑 RNA提取使用的Trizol購自Invitrogen公司；PCR反應所用的Ex Taq，dNTP mixture，pMD18-T載體，RNase Inhibitor，PrimeScript?RT reagent Kit（Perfect Real Time），SYBR?Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time），均購自TaKaRa公司；反轉錄酶M-MLV RT購自Promega公司；DNA凝膠回收試劑盒和PCR清潔試劑盒為Axygen公司產品；大腸桿菌TOP10感受態細胞購自天根生化科技有限公司；其他生化試劑購自丁香園生物技術有限公司，引物由上海博道生物技術公司合成，序列測定由華大基因完成。

1.2方法

1.2.1海州香薷總RNA提取及cDNA合成 采用Trizol法提取兩個種群海州香薷根部的總RNA，具體操作步驟參照說明書。反轉錄酶與引物Oligo（dT）18引導cDNA第一鏈的合成。0.2 mL離心管中依次加入12.5 μL總RNA，3 μL Oligo（dT）18，11 μL DEPC處理的水，70℃溫浴5 min，迅速置于冰上冷卻，微離心收集溶液至離心管底部，再依次加入5×M-MLV RT Buffer 10 μL，RNase Inhibitor 1.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）10 μL，M-MLV RT 2 μL，用移液槍吸打混勻，42℃反應60 min，70℃溫浴10 min失活反轉錄酶，冰上分裝后-20℃保存備用。

1.2.2EhNvINV和EhCvINVcDNA全長序列克隆 根據GenBank中海州香薷非抗性種群液泡轉化酶基因EhNvINV（JX500755）和抗性種群轉化酶基因EhCvINV（JX500756）序列，設計特異性引物V-FullF和V-FullR（表1）。以反轉錄所得的cDNA為模板，進行PCR反應，反應體系為20 μL：10× Ex Taq Buffer（Mg2+plus）2 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）1 μL，PrimerF 1 μL，PrimerR 1 μL，cDNA 1μL，Ex Taq 0.2 μL，ddH2O 13.8 μL。全長PCR反應程序為：94℃預變性5 min；98℃變性10 s，50℃退火15 s，72℃延伸2 min，32個循環72℃延伸10 min。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收、連接、轉化、菌液PCR檢測和陽性克隆測序。

表1　海州香薷液泡轉化酶基因cDNA全長克隆及RT-PCR引物

1.2.3基因序列分析 使用NCBI網站的BLAST在線軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）進行海州香薷兩個種群液泡轉化酶基因全長序列的同源性比對分析與相似性搜索。使用ClustalX軟件將海州香薷和其他物種液泡轉化酶基因的氨基酸序列進行比對［7］。使用MEGA4.1軟件構建海州香薷液泡轉化酶基因的無根系統進化樹［8］。

1.2.4蛋白結構分析 使用在線ExPASy序列分析工具（http：//au.expasy.org/tools/）對推導的氨基酸序列進行分析，ProtParam分析蛋白的氨基酸序列組成、相對分子質量、等電點等理化性質。將海州香薷兩個種群液泡轉化酶的氨基酸序列提交至在線分析工具SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）進行同源建模，選擇擬南芥（Arabidopsis thaliana）酸性轉化酶基因AtcwINV1的3D蛋白結構（PDB：2AC1，www.pdb.org）為模板，預測海州香薷液泡轉化酶蛋白EhNvINV和EhCvINV的三級結構。

1.2.5分子模擬對接 海州香薷液泡轉化酶蛋白與蔗糖分子的模擬對接采用自動對接軟件AutoDock4.0完成。蔗糖分子結構來自于MMsINC數據庫（http：// mms.dsfarm.unipd.it/MMsINC/）。選擇液泡轉化酶活性中心的GLU299設置為柔性殘基。蛋白分子和蔗糖分子在對接過程中同時被賦予Geister Huckel電荷，Grid大小設置為26×28×28（x、y和z），格點間隔為默認值0.375 ?，Grid中心坐標設置為74.158，112.502，-4.938（x、y和z）。Number of GA Runs設置為30，其他參數均使用系統默認參數。對接過程使用拉馬克遺傳算法（lamarckian genetic algorithm，LGA）對結合位點進行搜索和能量評價，選擇結合自由能最低的構象為最終的結合模式。同源模擬生成的PDB文件以及分子對接結果均使用PyMOL軟件顯示和分析。

1.2.6Real-time PCR反應 根據海州香薷EhNvINV和EhCvINV基因的序列，設計Real-time PCR的上下游引物V-rtF和V-rtR（表1）。以EhACT為內參基因［9］，設計定量PCR引物Actin-F和Actin-R（表1）。使用StepOneTMReal-Time PCR System（Applied Bio-systems，USA）分析EhNvINV和EhCvINV在銅脅迫下的轉錄表達。幼苗水培10 d后進行銅處理，銅處理設對照組（不加銅）和處理組（加10 μmol/L Cu2+），Cu2+以CuCl2·2H2O的形式加入營養液中。銅分別處理1 d和7 d后收獲植物，RNA提取方法同上所述，按照PrimeScript?RT reagent Kit說明書的步驟進行反轉錄，染料使用SYBR?Green I（TaKaRa，Japan）。反應條件如下：95℃預變性30 s后，用兩步法進行擴增，即95℃變性5 s，60℃退火和延伸30 s，共40個循環，PCR擴增結束后作60-95℃的熔解曲線。所有Real-time PCR試驗均設置3個生物學重復和3個操作重復。結果表示為樣品基因的轉錄表達量相對于非抗性種群對照組表達量的倍數。反應結束后收集Ct值，基因的相對表達量采用2-△△Ct法進行計算。

2　結果

2.1海州香薷總RNA提取

海州香薷根中的總RNA經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測呈現3條清晰的條帶，其中28S rRNA的亮度約為18S rRNA的兩倍，5S rRNA亮度較低，無明顯降解，紫外分光光度計測定RNA樣品OD260/OD280的平均值為1.91，表明所提取的總RNA質量較好，可用于反轉錄反應。

2.2海州香薷EhNvINV和EhCvINV基因序列分析

PCR擴增分別得到約1 900 bp大小條帶，經測序，非抗性和抗性種群液泡轉化酶基因的開放閱讀框均為1 914 bp，編碼637個氨基酸，EhNvINV和EhCvINV的核苷酸序列相似性為98.80%，編碼的氨基酸序列相似性為99.69%。海州香薷與NCBI上公布的其他部分雙子葉植物液泡轉化酶氨基酸推導序列的同源性比較，見表2。海州香薷與胡蘿卜（Daucus carota）和咖啡（Coffea canephora）的相似性最高，達75%。

表2　海州香薷非礦區種群與其他物種液泡轉化酶氨基酸推導序列的同源性比較

海州香薷與部分其他物種液泡轉化酶基因推導的氨基酸序列的多重比對結果，見圖1。EhNvINV和EhCvINV均具有植物液泡轉化酶的13個保守區域，其中包括液泡轉化酶的兩個最為保守的特征序列β-呋喃果糖苷基序（NDPN）和半胱氨酸殘基催化區（WECVD），EhNvINV和EhCvINV具有5個糖基化位點（NXS/T）。兩個不同抗性種群的液泡轉化酶氨基酸序列存在趨異位點，EhNvINV的第114和346位氨基酸分別為Glu和Leu，而EhCvINV對應位點的氨基酸為Gln和Pro。這些趨異位點都位于13個保守區域外。

為進一步證實所克隆的基因屬于海州香薷液泡轉化酶基因，構建了與其他物種液泡轉化酶、細胞壁轉化酶和果糖基轉移酶的無根進化樹。結果（圖2）顯示，進化樹分為4個類群，分別為（Ⅰ）果糖基轉移酶、（Ⅱ）單子葉植物液泡轉化酶、（Ⅲ）雙子葉植物液泡轉化酶、（Ⅳ）雙子葉植物細胞壁轉化酶。EhNvINV和EhCvINV屬于雙子葉植物液泡壁轉化酶。

2.3海州香薷EhNvINV和EhCvINV蛋白基本特征

兩個種群海州香薷液泡轉化酶蛋白的氨基酸組成基本一致，天冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）、絲氨酸（Ser）和纈氨酸（Val）含量較高，均高于6%，無吡咯賴氨酸（Pyl）和含硒半胱氨酸（Sec）（圖3）。推導的非抗性種群液泡轉化酶蛋白

原子總數為9 933個，分子式C3226H4910N822O964S11，分子量為70.986 kD，理論等電點為4.89。抗性種群液泡轉化酶蛋白原子總數為9 929個，分子式C3225H4907N823O963S11，分子量為70.969 kD，理論等電點為4.91。

2.4海州香薷EhNvINV和EhCvINV蛋白3D結構

非抗性和抗性種群海州香薷液泡轉化酶蛋白的3D結構相似，僅在趨異位點Glu114/Gln114和Leu346/Pro346處有細微的差別，如圖4所示。液泡轉化酶蛋白由N-末端類似螺旋槳形狀的β-轉角結構域和C-末端的β-折疊區組成，這兩個結構域由兩個較短的α螺旋連接。其中N-末端的結構域由5個β轉角組成，主要負責與底物蔗糖結合，是酶的催化中心，C-末端的結構域由2組反向平行的β折疊組成。

2.5海州香薷EhNvINV和EhCvINV蛋白模擬突變與分子對接

本研究從液泡轉化酶蛋白與底物結合的角度進行了計算機模擬分析，以EhNvINV為基礎，在兩個種群間的趨異位點處進行模擬定點突變，獲得突變體酶蛋白分子EhNvINV-E114Q和EhNvINV-L346P，并分別與蔗糖分子進行對接。首先使用擬南芥酸性轉化酶蛋白AtcwINV1（PDB ID：2AC1）［10］、突變體AtcwINV1-E203Q（PDB ID：2OXB）、AtcwINV1-E203A（PDB ID：2QQV）和AtcwINV1-D239A（PDB ID：2QQU）［11］的晶體結構模型檢測海州香薷液泡轉化酶蛋白與蔗糖的對接程序，確保對接結果的可靠性。

液泡轉化酶與蔗糖分子的對接模擬結果（圖5）顯示，蔗糖分子在EhNvINV和EhCvINV催化活性中心的構象基本一致，呋喃果糖環上的氧原子O6分別與Q136上的OE1和W144上的NE1，O4分別與T180上的N和D244上的OD1，O3分別與D244上的OD2、R243上的NE和E299上的OE2，O2與N119上的ND2，O1與D120上的OD1之間形成氫鍵相互作用。吡喃葡萄糖環上的O2與E299上的OE2，O3與D332上的OD2之間也形成了氫鍵相互作用，使蔗糖分子穩定地結合在液泡轉化酶的催化活性中心。

突變體EhNvINV-E114Q和蔗糖分子的對接構象與EhNvINV基本一致，而對于EhNvINV-L346P，與EhNvINV和蔗糖分子的對接構象相比較，呋喃果糖環上的氧原子O6與W144上的NE1，O3與R243上的NE無氫鍵相互作用，而O4與Q136上的OE1，O1與N119上的ND2之間具有氫鍵相互作用。EhNvINV、EhCvINV、EhNvINV-E114Q、EhNvINVL346P與蔗糖分子的對接模型表明蔗糖分子在酶活性中心的空間位置上存在細微差異，計算機模擬對接的結合能差異較小（表3），分別為-6.03 kcal/ mol、-6.00 kcal/mol、-6.04 kcal/mol和-5.99 kcal/mol。

圖1　海州香薷與其他物種液泡轉化酶氨基酸序列的多重比對結果

2.6銅脅迫下海州香薷EhNvINV和EhCvINV基因轉錄表達差異

銅脅迫下海州香薷EhNvINV和EhCvINV基因相對轉錄表達量如圖6所示，銅處理1 d后，與對照組相比，海州香薷EhNvINV基因的轉錄表達量顯著升高（P ＜ 0.05），銅脅迫下，EhNvINV的轉錄表達量顯著高于EhCvINV（P ＜ 0.05）。銅處理7 d后，EhNvINV基因的轉錄表達量與對照組無顯著表達差異，而EhCvINV基因的轉錄表達量與對照組相比顯著升高（P ＜ 0.05），且比EhNvINV基因在銅脅迫下的轉錄表達量高約4.5倍。

圖2　海州香薷液泡轉化酶與其他植物酸性轉化酶和果糖基轉移酶的無根進化樹分析

圖3　海州香薷非抗性和抗性種群液泡轉化酶蛋白氨基酸組成

3　討論

圖4　海州香薷兩個種群液泡轉化酶蛋白模擬3D結構

本研究克隆的EhNvINV和EhCvINV具有植物液泡轉化酶基因的多個保守序列（圖1），包括β-呋喃果糖苷酶（NDPN）和催化區域的重要組成部分（WECP/VD）這兩個最為保守的特征基序。幾乎所有高等植物的液泡轉化酶在催化區域的保守位點上都有一個纈氨酸（V）［12］，海州香薷非抗性和抗性種群液泡轉化酶（EhNvINV和EhCvINV）也同樣如此。植物酸性轉化酶和果糖基轉移酶的同源性較高，具有相同的保守區域，如蔗糖結合基序、RDP基序和EC基序［13］。但液泡轉化酶與細胞壁轉化酶和果糖基轉移酶的區別主要在于前者具有一些典型的特征序列，如所有雙子葉植物和大部分單子葉植物的液泡轉化酶在前肽區域具有一個保守序列R［G/A/P］XXXGVS［E/D/M］K，所有已知的液泡轉化酶在成熟蛋白起始位點附近有一個保守序列WXXX［M/IV］LXWQ［14］。EhNvINV和EhCvINV具有這兩個保存序列RGVAQGVSEK（第74-83位氨基酸）和WTNVMLSWQ（第97-105位氨基酸）。分子進化樹分析也表明EhNvINV和EhCvINV屬于雙子葉植物液泡轉化酶基因家族成員。

表3　海州香薷液泡轉化酶及模擬突變體與蔗糖對接的最佳結合能

圖5　海州香薷細胞壁轉化酶蛋白及模擬突變體與蔗糖的對接模型示意圖

圖6　銅處理1 d和7 d后海州香薷兩個種群根中EhNvINV和EhCvINV基因的相對轉錄表達量

海州香薷非抗性種群液泡轉化酶EhNvINV與抗性種群液泡轉化酶EhCvINV的氨基酸序列存在兩個趨異位點，這可能是由于抗性種群長期生活在銅脅迫下發生了適應性進化。研究表明氨基酸序列的改變可能會導致蛋白活性的改變，如Ritsema等［15］報道，替換洋蔥（Allium cepa）液泡轉化酶中的33個氨基酸（第143-175位），將會使液泡轉化酶的蛋白活性從水解蔗糖變為糖基轉移（把蔗糖轉換成果聚糖）。NDPN基序和EC基序在轉化酶中高度保守，如果將Asp23替換為Asn23，或者將Glu203替換為Ala203，轉化酶將失去活性［16］。除高度保守的NDPN、RDP和EC基序外，其附近的氨基酸殘基Trp82、Asp239和Lys242對于底物分子結合的穩定性也具有重要意義，這些位點的突變將改變轉化酶水解蔗糖的活性參數，如Km和Kcat值［11，17，18］。海州香薷液泡轉化酶EhNvINV和EhCvINV對應的NDPN、EC和RDP基序中3個保守的同源氨基酸分別為Asp120、Asp244和Glu299。AtcwINV1的Trp82、Asp239和Lys242同氨基酸在EhNvINV和EhCvINV中分別為Trp144、Asp332和Lys335，EhNvINV和EhCvINV的趨異氨基酸位點均不在上述活性位點或其附近。

EhNvINV和EhCvINV的2個趨異位點雖然不在活性中心，但Glu114/Gln114靠近活性中心，且Glu114/Gln114緊鄰保守區域YHFQP（109-113）和WMNDPNGP（117-124）。這些氨基酸殘基結構的差異可能會導致其臨近區域的蛋白構象發生細微改變，而這種細微改變可能會影響到蛋白的穩定性或活性。在玉米（Zea mays）細胞壁轉化酶INCW2中，C末端的一個胞嘧啶突變為胸腺嘧啶導致Pro變為Leu，盡管這個突變位點不在催化活性中心（WECPD），不在糖基化位點，也不在β-呋喃果糖基序（NDPNG）中，但突變使INCW2的蛋白活性在Incw2轉錄正常的情況下僅為正常值的6%，這可能是由于該位點的Pro被替換后降低了整個蛋白的穩定性［19］。計算機模擬結果（圖4）顯示，海州香薷不同抗性種群液泡轉化酶的趨異位點未造成蛋白構象的顯著差異，分子對接結果表明EhNvINV和EhCvINV與蔗糖分子的結合構象基本一致，且與蔗糖分子對接的結合能差異較小，可能趨異的氨基酸位點對活性中心的構象沒有產生影響。然而蔗糖分子與液泡轉化酶蛋白催化活性中心氨基酸之間的空間距離具有細微差異（圖5），這種細微差別可能是由于趨異氨基酸的結構差異導致其附近的氨基酸殘基的構象發生了改變，盡管這種改變很小，但也可能會傳遞至活性中心的氨基酸，從而使活性中心底物結合的口袋構象表現出細微的差異，這種構象上的細微差異是否會導致不同種群間液泡轉化酶的活性表現出顯著差異還需實驗進行驗證。

實時熒光定量PCR結果（圖6）表明，銅脅迫1 d后EhNvINV的表達顯著高于EhCvINV，這可能是由于非抗性種群在受到銅脅迫后產生的應激反應，誘導液泡轉化酶大量表達。銅脅迫7 d后，EhNvINV基因的表達受到抑制，這可能與液泡轉化酶受多種脅迫調控相關。液泡轉化酶基因的表達會受到外界環境條件的抑制，如小麥（Triticum aestivum）在受到短暫的缺水脅迫后，其花藥的液泡轉化酶基因Ivr5在雄性減數分裂期下調表達［20］。玉米子房在干旱脅迫下也表現出液泡轉化酶mRNA表達量下降［21］。銅脅迫7 d后EhCvINV表達量顯著升高，這可能是因為抗性種群在長期的銅脅迫環境下進化的抗性機制使之與非抗性種群的液泡轉化酶基因表達存在差異。由于在銅脅迫下抗性種群的海州香薷需要大量的己糖提供碳源和能量用于維持脅迫響應，液泡轉化酶基因可能在銅脅迫條件下對海州香薷的微進化過程中起著輔助基因的作用。因此，在海州香薷定居銅綠山高濃度銅含量環境的進化過程中，銅脅迫誘導作用可能強化了液泡轉化酶基因表達的水平，從而使EhCvINV的轉錄表達量高于EhNvINV。環境脅迫抗性植物通常通過上調表達酸性轉化酶基因，產生更多的小分子碳水化合物（葡萄糖和果糖）作為碳源和能量用于適應環境脅迫。如耐低溫水稻品種R31的細胞壁轉化酶基因OSINV4表達不會受到低溫的抑制［22］。液泡轉化酶基因在銅脅迫下的表達差異不僅在海州香薷的兩個不同抗性種群中表現，在羊蹄［23］和齒果酸模［24］中也有報道，均表現為非抗性種群的液泡轉化酶基因表達受到銅的抑制，而抗性種群受銅的誘導。

4　結論

本研究克隆的EhNvINV和EhCvINV基因屬于液泡轉化酶基因家族成員，推導的蛋白序列存在2個氨基酸趨異位點，其中非抗性種群液泡轉化酶EhNvINV在114和346位分別為谷氨酸和亮氨酸，而抗性種群液泡轉化酶EhCvINV在這兩個位點分別為谷氨酰胺和脯氨酸。

同源模擬表明二者的3D結構相似，僅在趨異位點Glu114/Gln114和Leu346/Pro346處有細微的差別。EhNvINV、EhCvINV和模擬突變體（EhNvINVE114Q和EhNvINV-L346P）與蔗糖分子對接形成的活性中心構象基本一致，但在空間位置上存在細微差異，這些結構上的差異可能是造成兩個種群細胞壁轉化酶活性差異的原因之一。

銅脅迫7 d后，EhCvINV的轉錄表達量顯著高于EhNvINV，可能是抗性種群在長期的銅脅迫環境下進化的抗性機制需要更多的己糖提供碳源和能量來維持。

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（責任編輯 李楠）

Sequence Divergence and Analysis of Expression Difference of Vacuolar Invertase Gene EhvINV from Different Resistant Populations in Elsholtzia haichowensis

CAI Shen-wen1，3XU Zhong-rui2XIONG Zhi-ting2，3WANG Jia-zhen4CHEN Yao4
（1. College of Resources and Environment，Zunyi Normal College，Zunyi 563002；2. School of Resource and Environmental Sciences，Wuhan University，Wuhan 430079；3. Hubei Biomass-Resource Chemistry and Environmental Biotechnology Key Laboratory，Wuhan 430079；4. College of Life Science，Zunyi Normal College，Zunyi 563002）

Specific primers were designed to clone the cDNA sequences according to the EhNvINV（JX500755）and EhCvINV（JX500756）from GenBank. The DNA and deduced amino acid sequences were analyzed by bioinformatics methods. The three-dimensional structures were constructed by homologous modeling. The structures of vacuolar invertase from two populations of E. haichowensis and nontolerant population with each single point mutation in complex with sucrose were simulated by AutoDock 4.0. Transcript expression of EhNvINV and EhCvINV under copper tress was analyzed by real-time PCR. The results showed that there were two divergent amino acids at position 114 and 346 between EhNvINV and EhCcINV. The three-dimensional structures were exactly similar between EhNvINV and EhCvINV. It showed difference at Glu114/Gln114 and Leu346/Pro346，which were divergent sites. The structures of catalytic active center of EhNvINV，EhCvINV，and simulated mutants（EhNvINV-E114Q，EhNvINV-L346P）binding with sucrose showed no significant differences. However，there were differences on spatial position. The result of real-time PCR indicated that the transcript expression of EhCvINV induced by copper stress after 7 days，however，the transcript expression of EhNvINV inhibited by copper stress after 7 days.

Elsholtzia haichowensis；vacuolar invertase；copper stress；transcript expression

2016-04-19

國家自然科學基金項目（21477093，31270432），生物質資源化學與環境生物技術湖北省重點實驗室開放基金項目（HBRCEBL-2013-2014004），遵義師范學院博士基金項目（遵師BS［2014］20號）

蔡深文，男，博士，副教授，研究方向：環境生物學；E-mail：caishenwen@163.com