甘蔗小分子量熱激蛋白（sHSP）基因克隆及水分脅迫下的表達分析

梁潘霞黃杏李楊瑞

（1. 廣西農業科學院資源與環境研究所，南寧 530007；2. 中國農業科學院甘蔗研究中心 農業部廣西甘蔗生物技術與遺傳改良重點實驗室廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室，南寧 530007）

甘蔗小分子量熱激蛋白（sHSP）基因克隆及水分脅迫下的表達分析

梁潘霞1黃杏2李楊瑞2

（1. 廣西農業科學院資源與環境研究所，南寧 530007；2. 中國農業科學院甘蔗研究中心 農業部廣西甘蔗生物技術與遺傳改良重點實驗室廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室，南寧 530007）

為甘蔗抗逆脅迫機制研究提供依據，以甘蔗葉片總RNA為模板，通過 RT-PCR 擴甘蔗小分子量熱激蛋白（sHSP）基因的cDNA，采用生物信息學軟件分析所克隆基因的編碼蛋白特性，并用熒光定量PCR分析該基因的表達情況。結果表明，克隆得到的cDNA片段長度為659 bp，包括1個459 bp的開放閱讀框，編碼132個氨基酸。同源性分析表明，sHSP基因在14個不同植物中的一致性為69%-96%。甘蔗sHSP具有典型的HSP結構域，并且非常保守。實時熒光定量分析結果表明，隨著甘蔗干旱脅迫時間的延長，sHSP基因表達量緩慢下降后明顯增加，干旱脅迫加硅處理的甘蔗葉片sHSP基因表達量峰值出現比干旱處理推遲48 h。說明sHSP受到了干旱脅迫的誘導表達，同時硅能提高甘蔗抗旱性。

甘蔗；干旱；硅；熱激蛋白

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.020

甘蔗是我國乃至世界重要的糖料作物，也是重要的生物能源作物。甘蔗作為廣西農業主要的經濟作物之一，對農民增收起重要的推動作用。但廣西地區甘蔗大部分種植于耕作層淺薄且缺乏灌溉條件的丘陵旱坡地上，而由于氣候變化異常，尤其是季節性干旱給甘蔗生產造成巨大的損失［1］。研究表明，甘蔗是喜硅（Si）作物，施用適量Si能促進甘蔗的光合作用［2］，提高甘蔗產量和糖分含量［3］，增強甘蔗抗逆性及對土壤具有一定的改良作用［4］，但迄今未見有關硅增強甘蔗抗旱性分子機理研究的報道。

低分子量熱激蛋白（small heat shock proteins，sHSP）在原核生物和真核生物中廣泛存在，熱激蛋白早期研究證實與高溫脅迫有關［5］，隨著研究的深入，低溫、氧化劑、干旱脅迫也可誘導sHSP基因的表達，說明sHSP與植物的逆境脅迫存在一定的關系，是植物在逆境下產生的應激蛋白［6］。向日葵在水分脅迫時HSP被大量表達，并與水分喪失呈正相關關系［7］；轉sHSP17.7水稻干旱處理后植株存活率高達70%［8］；擬南芥干旱敏感突變株小分子熱激蛋白基因HSP17.4表達量很低，熱誘導后則大量表達，并提高了抗旱性［9］。目前已從玉米［10］、花生［11］、杧果［12］、小麥［13］、巴西橡膠樹［14］等植物中克隆出了熱激蛋白，但還未見甘蔗小分子熱激蛋白基因的克隆研究報道。為此，本研究利用RT-PCR克隆了甘蔗sHSP基因，通過熒光定量技術初步探明HSP基因在甘蔗干旱脅迫下的表達情況，旨為深入探索HSP基因在甘蔗抗旱分子機理研究提供證據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料 選取新臺糖22號（ROC22）為研究材料，沙培幼苗長至2-3片真葉后，選取長勢健壯且生長一致的幼苗，轉移到不透光的塑料箱中，每箱裝有25 L硅濃度為1.7 mol/L 的1/2 Hoagland營養液（營養液pH用H2SO4稀溶液調至5.8）。當幼苗在含硅的1/2 Hoagland營養液中生長至5-6片真葉時，加入200 g/L的PEG-6000進行模擬干旱脅迫（Si+PEG）。以不加硅的1/2 Hoagland營養液培養的苗進行模擬干旱處理設為PEG，無硅和模擬干旱脅迫的為對照（CK），分別在模擬干旱處理0、18、 40、63、96和144 h取樣（+1葉），將采好的樣品立即保存于-80℃冰箱備用。

1.1.2試劑 大腸桿菌DH5α、BL21、pMD18-T載體、凝膠回收試劑盒購自Bioer公司；M-MLV逆轉錄酶、均購自TaKaRa寶生物工程有限公司（中國大連）公司，dNTP、Taq DNA聚合酶、硅酸鈉購自上海生工，Trizol購自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成 提取甘蔗葉片總RNA，具體參照Invitrogen公司的Trizol說明書，cDNA合成用M-MLV逆轉錄酶，逆轉錄引物為Oligo（dT）18：5'-GGCCACGCGTCG ACTAGTAC（T）18-3'，具體步驟按說明書進行，完成后取5 μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查并用紫外分光光度計檢測cDNA濃度，最后將各處理cDNA濃度稀釋至同一濃度。

1.2.2HSP基因的克隆 依據GenBank數據庫中已知的高粱、玉米、水稻、小麥等植物sHSP基因的核酸序列為參照，利用DNAMAN 軟件在基因起始密碼子位置設計HSP基因上游簡并引物HSP：5'-ATGTCGCT（C/G）GTGAG（G/T）CGCAGCA（A/G）CG-3'，下游引物為逆轉錄加尾引物 3 side：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'。

擴增甘蔗HSP基因的PCR體系為25 μL，模板以不同處理的cDNA 等量混合樣。PCR擴增參數為：95℃ 5 min；95℃ 40 s，58℃ 45 s，72℃ 2 min，共35個循環；72℃延伸10 min。PCR結束后加2μL核酸染料混勻后經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測條帶大小正確后，回收純化目的條帶，連接到pMD18-T載體，熱激轉化感受態細胞大腸桿菌DH5α，通過藍白斑篩選挑取白色菌落，經菌液PCR驗證為陽性克隆子后送上海生工測序，測序結果經拼接后在NCBI BLAST進行比對。

1.2.3HSP基因生物信息學分析 用BioXM2.6軟件推導該基因氨基酸序列，在NCBI的BLAST上進行相似性比對；Clustalx軟件進行多重序列比對；MEGA6軟件構建進化樹；在線網站（http：//isoelectric. ovh.org/）預測甘蔗HSP的蛋白質分子量和等電點；用WoLF PSORT在線軟件對該基因進行亞細胞定位；用SOSUI signal軟件預測基因的信號肽；ExPASy Proteomics Server預測蛋白質的親水性和跨膜結構；SOPMA軟件預測基因的二級結構。

1.2.4HSP 基因的表達分析 根據獲得的甘蔗HSP基因的開放閱讀框序列設計實時熒光定量引物HSPQF：5'-AGCATCCAGATCTCCGGTTG-3'、HSPQR：5'-GACATACCAAAGCAGAGTAACCA-3'；以甘蔗管家基因 25S作內參，設計內參引物25S F：5'-GCAGCCAAGCGTTCATAGC-3'、25S R：5'-CCAGCTCACGTTCCCTATTG-3'，實時熒光定量PCR在ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀上進行，PCR反應體系為20 μL，具體方法參照天根公司熒光定量試劑盒Real Master Mix（SYBR GreenⅠ）說明書。PCR擴增參數為：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，72℃ 30 s，共40個循環。所有樣品在同一臺PCR儀上進行擴增，每個樣品重復3次，根據熒光PCR擴增CT值，按照 2-ΔΔCt法計算出基因相表達量。

2　結果

2.1sHSP基因全長cDNA克隆

以甘蔗品種ROC22 幼苗在模擬干旱處理條件下，樣品葉片的混合RNA逆轉錄cNDA為模板，用簡并引物HSP和3 side進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（圖1）顯示，從cDNA中擴增得到長約600 bp的條帶。對得到的序列（登錄號為JQ712579）通過GenBank Blast搜索比對，顯示結果為小分子量熱激蛋白（sHSP）。sHSP全長659 bp，包含啟始密碼ATG 和終止密碼TGA，為sHSP基因全長序列。該基因cDNA包含一個459 bp（從第1-459 bp）的完整開放閱讀框（Open reading frame，ORF），編碼152 個氨基酸，還包含200 bp的3'非編碼區，該區域有個19 bp ployA 尾巴。

圖1　甘蔗sHPS序列擴增結果

2.2sHSP基因生物信息學分析

用在線網站（http：//isoelectric.ovh.org/）預測sHSP基因所編碼的氨基酸序列的蛋白質分子量為17.15 kD，等電點為5.83。sHSP亞細胞定位于細胞質。SOSUIsignal軟件預測sHSP的信號肽，顯示該基因不含信號肽，為可溶性蛋白；sHSP疏水性預測最小值為-4.5，最大值為4.5，sHSP無跨膜區域。在氨基酸組成中，部分氨基酸使用頻率較高，如Val、Glu、Ser分別占總氨基酸的13.60%、10.53%和9.87%，一些出現頻率則較低，如His、Cln和Trp僅占1.97%、1.32%和1.32%。利用SOPMA 軟件完整的預測sHSP的二級結構，結果顯示，出現38個α-螺旋占25.00%，隨機卷曲43個占48.03%，延伸鏈占21.05%，β-轉角（5個）只占5.92%。另外sHSP序列沒有糖基化位點，有6個絲氨酸和2個蘇氨酸磷酸化位點。

甘蔗sHSP基因的氨基酸序列與其它物種同源性比較發現，除N端45個氨基酸序列的保守性較低外，在熱激蛋白功能區域非常保守，說明sHSP在進化過程中相當保守。利用NCBI Blast 檢索甘蔗sHSP基因核苷酸序列和編碼氨基酸序列同源的物種，結果（圖2）顯示，甘蔗sHSP基因與其它物種的核苷酸序列的同源性在79%-96%，與高粱最高為96%，其次是玉米93%。sHSP基因氨基酸序列與其它物種相比同源在69%-96%之間，其中與大豆的同源性最低為69%，與高粱的同源性最高為96%，其次是玉米為89%。不同物種sHSP基因序列的同源性較高，說明sHSP基因在進化過程中相當保守。用MEGA軟件，選擇Neighbor-Joining方法構建sHSP蛋白基因氨基酸序列進化樹，結果（圖3）顯示，甘蔗sHSP與高粱的進化關系最近，與李、擬南芥等物種sHSP進化關系較遠。

2.3sHSP基因在干旱脅迫下表達量分析

圖2　八種植物sHSP氨基酸序列多重比對

圖3　甘蔗sHSP基因與其它物種的同源性分析

圖4　熒光定量PCR檢測sHSP基因在甘蔗水分脅迫中的表達

以甘蔗管家基因25S作為內參，利用熒光定量技術分析了sHSP基因在甘蔗不同處理干旱脅迫下葉中的轉錄水平，結果（圖4）發現在干旱脅迫40 h之前兩個處理的sHSP表達量表現一樣，都出現緩慢下降，但同一處理不同時間之間該基因的表達量有顯著差異，在處理40 h干旱脅迫比對照減少了55.0%，硅加模擬干旱脅迫比對照減少了94.0%，但兩個處理模擬干旱脅迫40 h后sHSP的表達量都顯著升高，模擬干旱脅迫處理64和96 h時分別比對照升高了4.18和13.56倍，并在干旱脅迫144 h時迅速下降；而硅加干旱脅迫雖然在處理40 h后sHSP的表達量也迅速增加，但速度較慢，在處理64和96 h時分別比對照升高了2.02和4.80倍，在處理144 h時才出現最大值，比對照增加了44.64倍。這說明sHSP受到了模擬干旱脅迫的誘導表達，與干旱脅迫有一定的關系，另外干旱脅迫加硅比干旱處理推遲sHSP表達峰值出現的時間，說明硅在一定程度上能夠提高甘蔗抗旱性。

3　討論

熱激蛋白是一類植物體受到逆境脅迫時誘導合成的應激蛋白。熱激蛋白按分子量的大小分為：HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和smHSP（small HSP，15-30 kD）5個家族。對HSP 功能的研究一直是熱點，特別是熱激蛋白在高溫及低溫脅迫下的功能研究。其功能主要參與細胞內蛋白質的重新折疊、加工、穩定、轉運及蛋白質變性后的復性、胞內運輸、降解，以及修復受損的蛋白質等，維持胞內環境的穩定，從而保護植物細胞免受進一步的損傷，對減輕逆境引起的傷害有很大的作用［15，16］。

本研究以甘蔗為材料，克隆了甘蔗sHSP基因全長，通過與其它物種的序列比對發現，該基因與其它物種的氨基酸序列高度保守同源性高達69%-96%，大部分都高于75%，進一步說明HSP基因在進化中高度保守［17］。對該基因編碼的氨基酸序列功能預測顯示，有個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點SSTD，已有研究表明細胞質sHSP在應激激酶通路中具有抑制作用，能削弱逆境脅迫中依賴于ASK1的細胞凋亡［18］。在序列中還發現6個絲氨酸和2個蘇氨酸磷酸化位點，根據Abravaya［19］提出的HSF 活化的反饋調控模型，認為脅迫條件使HSF-HSP70復合體解離，HSF以單體形式被Ser/ Thr激酶磷酸化形成同源三聚體，經一系列轉運、結合、轉錄后使HSP的合成重新處于動態平衡。該基因在N末端出現一個細菌免疫球蛋白樣結構域MSLV，37-83位氨基酸序列發現一個MVP重復序列，雖然目前已經知道所有的HSF都具有這個保守的特征以及3個HSF成員抗原抗體反應不同，但還不清楚它們是受何種信號激活。

為進一步研究甘蔗sHSP基因在干旱脅迫下的表達模式，本研究從mRNA水平上對轉錄特性進行分析，表明sHSP基因在轉錄水平受到了干旱脅迫的誘導，在對照sHSP有一定的表達，可能是植物在外界生長環境中或多或少的受到一些因素的影響所致，之后兩個處理sHSP的表達量緩慢下降，說明甘蔗本身在干旱脅迫下有一定的適應能力，短期的干旱脅迫能提高甘蔗的耐旱性。在本研究條件下，甘蔗用PEG6000進行模擬干旱處理40 h，對提高甘蔗的耐旱性有一定的促進作用。之后幼苗sHSP的表達量急劇上升，說明甘蔗幼苗已受到了干旱脅迫的傷害，sHSP表達的上升是對干旱脅迫作出的應答反應，熱激蛋白上升能有效阻止蛋白質的變性，幫助變性蛋白重新折疊，恢復其功能。另外，HSP能促進細胞骨架形成，保護細胞結構穩定，減輕對膜的損傷和細胞脫水，從而減輕細胞受損程度［20，21］。單獨干旱脅迫在處理96 h時sHSP的表達量達到最大，之后急劇下降，推測這時甘蔗對干旱脅迫的防御能力已逐漸喪失。而加硅后干旱脅迫直到處理144 h才急劇上升達到處理的最大值，說明硅處理能提高甘蔗的耐旱能力。黃海榮等［4］、江澤普［22］、曾憲錄等［23］先后報道施硅肥能增強甘蔗光合作用。我們推測，施硅后能使硅在甘蔗葉片中沉積，從而提高細胞水勢，防止水分流失，使葉片更直立，改善光合作用從而提高甘蔗的抗旱性［24］。在干旱脅迫下，sHSPs 具有保護電子傳遞鏈穩定和增加光系統Ⅱ穩定性的作用，從而提高甘蔗光合作用和呼吸作用，穩定膜結構，提高甘蔗耐旱能力［25，26］。另外，大量的研究證明，熱激能使細胞內Ca2+濃度升高，CaM活性增加，促進CaM基因的表達，并提出一條新的熱激信號轉導途徑（鈣-鈣調素途徑），而Ca2+和CaM可能是熱激信號轉導途徑中的主要上游組分［27］。施硅肥能促進甘蔗對Ca、Mg、Mn等元素的吸收，是否甘蔗在施硅后通過這條信號轉導途徑來提高甘蔗耐旱性，有待進一步的研究。

4　結論

獲得的sHSP基因cDNA長度為659 bp，包括1個459 bp的開放閱讀框，編碼132個氨基酸，具有典型的HSP結構域。HSP基因在甘蔗干旱脅迫過程中起到增強甘蔗耐旱時間，提高抗旱性的作用。該基因GenBank登錄號為JQ712579。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning of Small Heat-shock Protein（HSP）Gene from Sugarcane and Analysis of Its Expression Under Drought Stress

LIANG Pan-xia1HUANG Xing2LI Yang-rui2
（1. Resources and Environment Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007；2. Sugarcane Research Center，Chinese Academy of Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement（Guangxi），Ministry of Agriculture/ Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement，Nanning 530007）

The present experiment was conducted to clone Small Heat-shock Protein（sHSP）in sugarcane to explore mechanism of stress resistance in sugarcane. sHSP was amplified using RT-PCR from sugarcane leaves，the characteristics of the deduced protein were analyzed using bioinformatics software and its expression was analyzed using quantitative real-time PCR. The results showed that the cDNA of HSP gene was 659 bp in full length with a 459 bp open reading frame，and encodes a putative sHSP protein with 152 amino acids. Comparison of the amino acids sequences homology in sHSP protein from 14 different species indicated that，the sHSP protein had 69% to 96% identity in amino acids sequence with other plants. The deduced amino acids sequence not only contained a typical sHSP domain，but also was conservative. The results of quantitative real-time PCR analysis showed that the mRNA of sHSP was decreased initially and then increased with time under drought stress. These results suggested that sHSP might be involved in function of water stress and drought resistance in sugarcane enhanced by Si application.

sugarcane；drought；silicon；HSP

2016-02-18

國家高技術研究計劃（“863”計劃）項目（2013AA102604），科技部國際合作項目（2013DFA31600），廣西自然科學基金項目（2014GXNSFBA118139），廣西農科院基本業務專項（桂農2014YD13）

梁潘霞，女，博士，研究方向：植物生理生化和生物技術；E-mail：lpx831@163.com

李楊瑞，男，博士生導師，研究方向：甘蔗生理生化和生物技術；E-mail：liyr@gxaas.net