槲皮黃酮對AMPK/NF-κB信號通路介導IL-6表達的影響

何標，廉果

(襄陽市中心醫院 藥學部，湖北 襄陽 441021)

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槲皮黃酮對AMPK/NF-κB信號通路介導IL-6表達的影響

何標，廉果

(襄陽市中心醫院 藥學部，湖北 襄陽 441021)

目的 探討槲皮黃酮介導AMPK/NF-κB信號通路對IL-6炎癥因子表達的影響。方法 RAW264.7細胞體外培養，采用LPS不同濃度及時間點誘導炎癥模型，ELISA法檢測IL-6含量；CCK8試驗檢測槲皮黃酮和LPS(1 ng/mL)對RAW264.7細胞抑制率的影響；槲皮黃酮處理細胞1 h后，加入LPS(1 ng/mL)培養48 h，ELISA法檢測IL-6含量；將細胞分為5組后，ELISA法檢測IL-6表達水平；Western blot檢測細胞核中NF-κB蛋白的表達水平。結果 LPS處理細胞后，分泌IL-6的量明顯高于對照組細胞；CCK8實驗表明槲皮黃酮和LPS對細胞的抑制作用較弱；槲皮黃酮處理后的細胞分泌IL-6的能力減弱；LPS+AMPK激活劑組、LPS+槲皮黃酮組、LPS+槲皮黃酮+AMPK激活劑組相對于LPS細胞組中IL-6的分泌受到抑制，并且細胞核內NF-κB的表達水平降低。結論 槲皮黃酮通過刺激AMPK含量來抑制NF-κB向細胞核的轉移，導致細胞核內NF-κB表達降低而起到抑制炎癥因子IL-6的分泌。

槲皮黃酮； 炎癥因子； 信號通路

槲皮黃酮(quercetin)是一類黃酮類化合物，具有顯著的抗氧化和抗炎癥活性，能夠治療多種疾病，如神經退行性疾病、腫瘤、糖尿病及肥胖癥等[1-5]。許多疾病的發生均與炎癥反應相關，若能對炎癥反應進行抑制，可有效改善某些疾病。有關研究表明腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)可介導炎癥反應的發生[6-8]，還參與細胞內的代謝和能量的平衡[9]。NF-κB是一種核轉錄因子，介導細胞核內許多蛋白因子的轉錄，包括調控炎癥因子的轉錄水平。有關研究報道，p-AMPK可以通過抑制NF-κB向細胞核內的轉移，從而阻止促炎性細胞因子的產生[10-12]。因此，核因子NF-κB為AMPK的下游作用蛋白。槲皮黃酮的抗炎癥活性是否通過AMPK/NF-κB信號通路來影響炎癥因子的表達水平未得到證實。本實驗通過細菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)誘導RAW264.7細胞炎癥模型，探討槲皮黃酮調控炎癥反應的分子機制，為槲皮黃酮的臨床應用提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

槲皮黃酮(Sigma,CAS No.117-39-5，質量分數≥99%)；AICAR(AMPK激活劑，美國，純度≥99%)；LPS(Sigma公司)；DMEM培養基(Gibcol公司)；胎牛血清(FBS,Gibcol公司)；GAPDH抗體、p-AMPK抗體、LaminB、NF-κB抗體(GeneTex，USA)；ELISA試劑盒(BOSTER公司)；RAW264.7細胞(南京科佰生物科技有限公司)。

1.2 主要儀器

Spectra max plus 384型酶標儀(Molecular Devices公司)；Odyssey近紅外掃描儀(LI-COR Biosciences)。

2 方法

2.1 細胞培養

RAW264.7細胞(小鼠單核/巨噬細胞)用高糖培養基(DMEM)培養，成分包括10%FBS、1%A-A(青霉素-鏈霉素)，于5%(φ)CO2、37 ℃培養箱中培養，待細胞長到80%～90%時便可用于傳代培養。傳代時先棄去舊培養基，用PBS清洗細胞2次，再加入胰酶消化細胞，待細胞變圓后加入新鮮培養基終止消化，離心倒掉上清，重懸細胞，并以1∶2比例進行傳代。

2.2 LPS誘導RAW264.7細胞分泌IL-6的研究

2.2.1 不同濃度LPS對IL-6分泌影響的研究 將RAW264.7細胞重懸后，以4×106個/孔細胞數接種于6孔板中，待細胞貼壁生長到80%～90%時后，每孔加入不同濃度的LPS(0.1、1、10、50 ng/mL)處理細胞，另設空白對照組，在5%CO2、37 ℃培養箱中繼續培養24 h，然后收集培養基，采用ELISA試劑盒檢測IL-6的分泌水平。

2.2.2 不同時間點LPS對IL-6分泌的影響 將RAW264.7細胞重懸后，以4×106個/孔細胞數接種于6孔板中，待細胞貼壁生長到80%～90%時后，每孔加入1 ng/mL的LPS，在5%CO2、37 ℃培養箱中分別培養3、6、12、24、48 h，然后收集細胞培養基，采用ELISA試劑盒檢測IL-6的分泌水平，并在不同時間點設置空白對照。

2.3 槲皮黃酮、LPS對細胞的毒性實驗

將RAW264.7細胞重懸后，以1×106個/孔細胞數接種于96孔板中，待細胞貼壁生長到80%～90%時，棄去舊培養基，每孔加入含槲皮黃酮(10、40、80 μg/mL)和LPS(1 ng/mL)的新鮮培養基，設3個復孔，于5%CO2、37 ℃培養箱中繼續培養24 h，然后吸去舊培養基，每孔加入含10 μL CCK8試劑新鮮培養基100 μL，繼續培養1 h后取出置于酶標儀中，于450 nm處測定吸光度值(A值)。

2.4 槲皮黃酮對細胞分泌IL-6的影響

將RAW264.7細胞重懸后，以4×106個/孔細胞數接種于6孔板中，將細胞分為對照組、LPS組、槲皮黃酮(10、40、80 μg/mL)組，待細胞貼壁生長到80%～90%時后，用槲皮黃酮處理細胞1 h后加入LPS(1 ng/mL)干預細胞48 h，然后收集各孔的細胞上清液，用ELISA試劑盒檢測IL-6的分泌水平。

2.5 槲皮黃酮通過刺激AMPK影響IL-6的分泌

將RAW264.7細胞重懸后，以1×107個/孔細胞數接種于直徑為10 cm2的培養皿中，將細胞分為對照組、LPS組、LPS+AMPK激活劑組、LPS+槲皮黃酮組、LPS+槲皮黃酮+AMPK激活劑組。各組加入的槲皮黃酮濃度均為40 μg/mL，干預1 h后加入LPS(1 ng/mL)干預細胞24 h，然后再用AMPK激活劑(AICAR，2 μmol/L)處理細胞，24 h后收集細胞上清液及細胞，采用ELISA試劑盒檢測上清中IL-6的含量。分別采用細胞質或細胞核蛋白提取試劑盒提取質(核)蛋白，于-80 ℃冰箱保存。

2.6 槲皮黃酮對p-AMPK(胞質)NF-κB(胞核)蛋白表達的影響

采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，采用Western blot技術檢測蛋白表達水平，每孔上樣50 μg蛋白質進行凝膠電泳，電泳完成后將蛋白轉移至PVDF膜，然后一抗孵育過夜，洗膜3次后二抗孵育1 h，利用Odyssey近紅外掃描儀對GAPDH、p-AMPK、LaminB、NF-κB表達水平進行檢測。

2.7 統計學處理

3 結果

3.1LPS促進RAW264.7細胞分泌IL-6

3.1.1 不同濃度LPS對IL-6分泌的影響 結果如圖1A所示，不同質量濃度的LPS處理細胞后，均能促進IL-6的分泌量，而LPS濃度為1ng/mL時，RAW264.7細胞分泌的IL-6量最多，與空白對照組細胞比較差異有統計學意義(P<0.05)。

3.1.2 不同時間點LPS對IL-6分泌的影響 結果如圖1B所示，當LPS質量濃度為1ng/mL時，RAW264.7細胞分泌IL-6的量隨時間的延長而不斷增加，與空白對照組細胞比較差異有統計學意義(P<0.05)。

*****2040600150010005000150010005000****105010.10ρ(LPS)/(μg?mL-1)ρ(IL-6)/(pg?mL-1)ABt/hρ(IL-6)/(pg?mL-1)

與空白對照細胞比較：*P<0.05。

圖1 LPS在不同濃度及不同時間點對RAW264.7細胞分泌IL-6的影響(n=3)

Figure 1 Influence of LPS at different concentrations and times on the secretion of IL-6 in RAW264.7 cells (n=3)

3.2 槲皮黃酮、LPS對細胞存活率的影響

結果表明，即使是高濃度的槲皮黃酮(80 μg/mL)和LPS(1 ng/mL)對細胞的存活率無明顯抑制效應，此時細胞存活率為(95.66±1.12)%，與對照組細胞比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3.3 槲皮黃酮對細胞分泌IL-6的影響

結果見圖2，與LPS組比較，槲皮黃酮(10、40、80 μg/mL)細胞組分泌的IL-6分別降低了45.8%、56.3%、61.4%，差異有統計學意義(P<0.05)。

150010005000**104080LPS0ρ(槲皮黃酮)/(ng?mL-1)ρ(IL-6)/(pg?mL-1)

與LPS組比較：P<0.05。

圖2 槲皮黃酮對LPS誘導的細胞IL-6分泌的影響

Figure 2 Influence of quercetin on the secretion of IL-6 in RAW264.7 cells stimulated by LPS

3.4 槲皮黃酮通過刺激AMPK影響IL-6的分泌

結果如圖3所示，LPS組細胞中IL-6的分泌量顯著高于對照組細胞，進一步說明細胞炎癥模型構建成功；與LPS組比較，LPS+AMPK激活劑組、LPS+槲皮黃酮組、LPS+槲皮黃酮+AMPK激活劑組中細胞分泌的IL-6均顯著降低(P<0.05)，說明槲皮黃酮通過刺激AMPK來抑制IL-6的分泌。

***10008006004002000ρ(IL-6)/(pg?mL-1)12345

1.對照組； 2. LPS組； 3. LPS+AMPK激活劑組； 4. LPS+槲皮黃酮組； 5. LPS+槲皮黃酮+AMPK激活劑組；

與LPS組比較：*P<0.05。

圖3 槲皮黃酮通過介導AMPK抑制IL-6的分泌

Figure 3 Inhibition of quercetin on IL-6 secretion in RAW 264.7 cells via AMPK

3.5 槲皮黃酮對p-AMPK(胞質)NF-κB(胞核)蛋白表達的影響

GAPDH、p-AMPK、LaminB、NF-κB表達水平檢測結果如圖4所示，LPS+AMPK激活劑組、LPS+槲皮黃酮組、LPS+槲皮黃酮+AMPK激活劑組細胞中p-AMPK表達水平相對于LPS組顯著降低，而核蛋白NF-κB的表達水平相對于LPS組顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。

12345123451.00.80.60.40.20p-AMPKGAPDHNF-κBLaminBBCAp-AMPK/GAPDHNF-κB/LaminB12345******

1.對照組； 2. LPS組； 3. LPS+AMPK激活劑組； 4. LPS+槲皮黃酮組； 5. LPS+槲皮黃酮+AMPK激活劑組；

與LPS組比較：*P<0.05。

圖4 槲皮黃酮對細胞中p-AMPK和NF-κB蛋白表達的影響(n=3)

Figure 4 Effect of quercetin on the expression of p-AMPK and NF-κB proteins in RAW264.7 cells (n=3)

4 討論

RAW264.7細胞為小鼠巨噬細胞，屬于免疫細胞，主要參與非特異性和特異性免疫反應，其分泌的炎癥因子是導致疾病發生的關鍵[13-14]。研究發現經典活化巨噬細胞可大量分泌促炎因子，如TNF-α、IL-1、IL-6等，而替代活化巨噬細胞則大量分泌抵抗素樣分子蛋白家族及殼多糖酶等[15]。

LPS是革蘭陰性菌外膜主要成分，對宿主具有毒害，其釋放入血液中達到一定程度會產生內毒素血癥。研究表明LPS可以通過與Toll樣受體(TLR4)結合激活炎癥信號通路，包括核因子NF-κB從細胞質向細胞核內的轉移，然后與目的基因的啟動子結合，促進炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6等的表達，導致炎癥反應的發生[16]。當LPS被TLR4受體識別后，與接頭分子MyD88結合，而活化IRAK后與腫瘤壞死因子受體相關因子-6(TRAF6)結合誘導其活化，再通過一系列級聯反應，促使NF-κB向細胞核內的轉移，刺激炎癥因子的表達。因此，本實驗采用LPS刺激RAW264.7細胞來建立炎癥細胞模型，為后續實驗研究槲皮黃酮抗炎癥活性的分子機制奠定了基礎。

大量研究表明，大量的中藥成分對免疫系統具有較好的調節作用，但其作用的分子機制研究較少。槲皮黃酮是一種黃酮類物質，具有較好的抗炎活性作用，而其對NF-κB信號通路是否有影響的研究未見相關報道。因此，本實驗通過建立細胞炎癥模型探討了槲皮黃酮抗炎活性的作用機制。筆者首先通過尋找LPS的最佳給藥劑量和給藥時間來誘導RAW264.7細胞炎癥模型；再通過CCK8實驗證實了槲皮黃酮和LPS均對RAW264.7細胞的存活率無明顯抑制作用。本實驗結果表明：與LPS組比較，LPS+AMPK激活劑組、LPS+槲皮黃酮組、LPS+槲皮黃酮+AMPK激活劑組中細胞分泌的IL-6均顯著降低(P<0.05)，說明槲皮黃酮通過刺激AMPK來抑制IL-6的分泌；LPS+AMPK激活劑組、LPS+槲皮黃酮組、LPS+槲皮黃酮+AMPK激活劑組細胞中p-AMPK表達水平相對于LPS組顯著升高，而核蛋白NF-κB的表達水平相對于LPS組顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。說明槲皮黃酮可以刺激AMPK的磷酸化水平，抑制NF-κB向細胞核內的轉移，降低炎癥因子IL-6的表達。

綜上所述，槲皮黃酮的抗炎癥活性可能是通過作用于AMPK/NF-κB信號通路來達到抗炎的效果，而槲皮黃酮是否存在其他的抗炎機制，尚需進一步研究。

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(責任編輯：幸建華)

Influence of quercetin on the expression of IL-6 by AMPK/NF-κB signaling pathway

HE Biao,LIAN Guo

(DepartmentofMedicine,XiangyangCentralHospital,Xiangyang441021,China)

Objective To investigate the influence of quercetin on the secretion of IL-6 by AMPK/NF-κB signaling pathway. Methods RAW264.7 cells were treated with lipopolysaccharide (LPS) at different concentrations and times,and the content of IL-6 was measured using ELISA.The viability of RAW264.7 cells treated with LPS and quercetin were detected by CCK8 assay and IL-6 levels were analyzed by ELISA.The activity of NF-κB was determined by western blot. Results The levels of IL-6 were increased in RAW264.7 cells after LPS challenge.There was no difference between quercetin and LPS on the viability of RAW264.7 cells.Treatment with quercetin inhibited the secretion of IL-6 in a dose-dependent manner.The levels of IL-6 and NF-κB activity were decreased in LPS-stimulated RAW264.7 cells when preconditioned with AMPK activator,quercetin or quercetin with AMPK activator. Conclusion Quercetin may inhibit IL-6 secretion in RAW264.7 cells by upregulation of AMPK activity,which decreases nuclear translocation of NF-κB.

quercetin; inflammatory factor; signaling pathway

2016-05-27

何標(1981—)，男，主管藥師，主要從事中藥藥理學研究，Email:384642983@qq.com；通信作者：廉果(1983—)，女，主管藥師，主要從事中藥藥理學研究，Email:362145782@qq.com。

時間：2016-09-30 10:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.1014.003.html

R285

A

1006-8783(2016)05-0634-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016052701