ATRA對兔頸動脈粥樣硬化斑塊和炎癥反應的影響

彭忠興，李翔，刁勝朋，黃葉青，程靜，劉愛群，危智盛，余青云，洪銘范

(廣東藥科大學附屬第一醫院 神經內科，廣東 廣州 510080)

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ATRA對兔頸動脈粥樣硬化斑塊和炎癥反應的影響

彭忠興，李翔，刁勝朋，黃葉青，程靜，劉愛群，危智盛，余青云，洪銘范

(廣東藥科大學附屬第一醫院 神經內科，廣東 廣州 510080)

目的 通過構建兔頸動脈粥樣硬化(AS)模型，觀察全反式維甲酸(ATRA)對AS斑塊中轉化生長因子-β1(TGF-β1)、兔白介素-6(IL-6)、兔白介素-10(IL-10)和兔白介素-17(IL-17)的表達水平，探討ATRA的抗AS作用及其機制。方法 選取34只純種雄性新西蘭白兔隨機分為正常組、模型組、他汀組、ATRA組。正常組給予基礎飼料，其余各組給予高脂飼料。實驗4周后他汀組予辛伐他汀2 mg/(kg·d)灌胃給藥，ATRA組予ATRA 20 mg/d灌胃給藥。12周末處死動物，取頸動脈組織觀察AS斑塊形態及炎癥反應情況，并測定血清中血脂、TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17的水平。結果 模型組頸動脈可見AS斑塊形成，內膜斷裂。他汀組及ATRA組內皮細胞形態和內膜尚完整。血清中TGF-β1和IL-10水平結果，ATRA組分別為(3 059.49±599.75)ng/L和(46.83±4.56)ng/L，他汀組分別為(2 709.48±601.44)ng/L和(43.13±4.07)ng/L，均比模型組的(2 039.16±638.07)ng/L和(36.39±7.34)ng/L顯著增高(P<0.05)。血清中IL-6和IL-17水平結果，ATRA組分別為(64.92±6.64)ng/L和(1 474.88±140.55)ng/L，他汀組分別為(69.54±8.84)ng/L和(1 518.58±136.69)ng/L，均比模型組的(110.00±7.26)ng/L和(2 002.66±195.57)ng/L顯著降低(P<0.05)。結論 ATRA具有抗AS的作用，其機制可能與ATRA的炎癥免疫調節作用有關。

頸動脈粥樣硬化； 全反式維甲酸； 轉化生長因子-β1； 炎癥

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是動脈粥樣硬化性腦梗死(atherosclerotic cerebral infarction,ACI)的主要病理基礎，頸AS的進展、斑塊的形成與破裂和繼發的血栓形成(即易損斑塊)是導致ACI的主要原因[1]。因此，抗AS治療是預防和治療ACI的主要措施之一，雖然臨床上針對AS的治療方法很多，但結果仍不夠理想，尋求新的治療靶點和新的藥物迫在眉睫。炎癥反應在AS的形成和發展過程中發揮了重要作用[2]，研究顯示全反式維甲酸(all-trans-ratinoic acid，ATRA)在炎癥及免疫反應中有著重要的調控作用[3]。本文旨在通過建立兔頸AS模型，觀察ATRA對AS影響，探討ATRA對頸AS中炎癥反應的機制，為新藥開發和臨床用藥提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性新西蘭大白兔34只，80 d齡，體質量(2.0±0.3)kg，廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，生產許可證號SCXK(粵)2013-0085。

1.2 試劑、藥品和主要儀器

基礎飼料(廣州花東信華實驗動物養殖場)；膽固醇(廣州拓科達生物科技有限公司)；兔轉化生長因子-β1(TGF-β1)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、白介素-17(IL-17)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)；ATRA(山東良福制藥有限公司，批號2012014)；辛伐他汀(杭州默沙東制藥有限公司20130146)；奧林巴斯BX51生物顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)；HITACHI 7180全自動生化分析儀(日本Hitachi公司)。

1.3 動物模型制備與分組

將健康純種雄性新西蘭白兔34只隨機分為4組：空白對照組(正常組)6只、模型組8只、辛伐他汀治療組(他汀組)10只、ATRA治療組(ATRA組)10只。正常組每日每只給予基礎飼料150 g，其余各組每日每只給予150 g高脂飼料(內含2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、15%蛋黃粉、10%豬油、72.5%基礎飼料)，4組均自由飲水，飼養12周。

他汀組和ATRA組高脂飼料飼養4周后開始灌胃給藥。他汀組予以辛伐他汀片按2 mg/(kg·d)給藥，稀釋于1.5 mL生理鹽水灌胃8周,直至實驗結束。ATRA組予以ATRA 20 mg/d溶于1.5 mL植物油中灌胃8周,直至實驗結束。模型組不使用任何藥物，但與治療組在相同時間予以等量生理鹽水灌胃8周,直至實驗結束。

1.4 血清血脂和炎癥細胞因子測定

各組動物于實驗12周末穿刺心臟采血，常溫靜置30 min后，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，測定血清中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的濃度。采用ELISA試劑盒測定血清中TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-17的水平，嚴格按照試劑盒和酶標儀說明書步驟進行操作。

1.5 血管形態學觀察及測定

實驗結束,處死動物,取約1.0 cm的頸動脈病變血管等距離切為3～4段，10%(φ)甲醛緩沖溶液固定，石蠟包埋。將病變血管橫切面(3～4 μm)行HE染色，光學顯微鏡下觀察管壁結構。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 血脂水平變化情況

表1結果顯示，與正常組比較，模型組和ATRA組的TG、TC和LDL-C顯著增高(P<0.05)；他汀組的TC和LDL-C顯著增高(P<0.05)。與模型組比較，ATRA組的TG、TC和LDL-C水平無明顯下降(P>0.05)；他汀組的TG、TC和LDL-C水平則明顯下降(P<0.05)。

表1 各組兔血清血脂水平比較

與正常組比較，#P<0.05； 與模型組比較：*P<0.05。

2.2 血管組織形態情況2.2.1 肉眼大體觀察 肉眼可見正常組兔頸動脈血管管壁光滑，柔軟有彈性；模型組兔頸動脈血管管壁增厚、僵硬，可見脂質點及脂質條紋，可見動脈粥樣硬化斑塊形成。他汀組、ATRA組兔頸動脈血管管壁增厚，略僵硬，偶可見脂質點，與正常組比較病變較輕。2.2.2 顯微鏡下觀察 經HE染色后顯示，正常組頸動脈的內皮細胞形態完整，排列整齊，內彈力纖維膜清晰完好，動脈中膜平滑肌細胞排列整齊，形態規則，未見明顯斑塊形成；模型組頸動脈可見典型的AS斑塊，內有纖維帽及脂質核心，以及大量炎性細胞浸潤，內彈力纖維膜斷裂，平滑肌細胞遷移至內膜下，動脈中膜可見泡沫細胞及膽固醇結晶。他汀組及ATRA組可見內皮細胞形態尚完整，部分中斷，內彈力纖維膜清晰完好，可見部分平滑肌細胞遷移至內膜下，動脈中膜平滑肌細胞排列尚整齊，可見部分泡沫細胞形成及少量炎性細胞浸潤。

A.正常組； B.模型組； C.他汀組； D. ATRA組。

圖1 實驗12周各組兔頸動脈血管HE染色(100×)

Figure 1 Morphology of rabbit carotid artery in different groups at 12 weeks (100×)

2.3 血清TGF-β1和IL-10水平檢測結果

如表2結果所示，與正常組比較，模型組血清TGF-β1和IL-10水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，他汀組及ATRA組血清TGF-β1和IL-10水平顯著增高(P<0.05)；ATRA組與他汀組比較，血清TGF-β1和IL-10水平差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 血清IL-6和IL-17水平檢測結果

表2結果顯示，與正常組比較，模型組血清IL-6和IL-17水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，他汀組和ATRA組血清IL-6和IL-17水平顯著降低(P<0.05)。

表2 各組兔血清TGF-β1 ELISA檢測結果

與正常組比較：#P<0.05； 與模型組比較:*P<0.05。

3 討論

AS是以血管壁內脂質蓄積、纖維成分增加和血管壁慢性炎癥為主要特征[4]，炎癥反應是AS發病的決定因素，貫穿了AS的形成和發展過程，因此抑制炎癥反應是抗AS的重要環節。

ATRA是一種天然維生素A的主要衍生物，ATRA通過與胞核上的受體結合，發揮對組織及細胞的抑制增生、誘導分化和調節凋亡的作用，且對于多種細胞因子、生長因子和激酶等都具有很強的調控增生、誘導分化的作用，是一種較強的分化誘導劑，在炎癥及免疫反應中有著重要的調控作用[3]。近年來，有ATRA類藥物應用于預防和治療AS和動脈管腔狹窄的動物實驗報道，但對AS的形成與發展中炎癥反應的抑制作用鮮有報道。

本研究結果顯示，兔經過高脂飼料飼養12周后其頸動脈肉眼及鏡下所見典型的AS斑塊形成，內彈力纖維膜斷裂，平滑肌細胞遷移至內膜下，動脈中膜可見泡沫細胞及膽固醇結晶，管腔狹窄，證明造模成功。模型組及治療組鏡下均可觀察到炎癥細胞浸潤，證實了炎癥介質參與了血管炎癥反應，參與了AS斑塊的形成。ATRA組及他汀組內皮細胞形態完整，內彈力纖維膜清晰完好，部分平滑肌細胞遷移至內膜下，動脈中膜平滑肌細胞排列整齊，部分泡沫細胞形成及少量炎性細胞浸潤，未見斑塊形成，提示ATRA及辛伐他汀均可以抑制內膜增生及平滑肌細胞的遷移，具有抗AS的作用，但ATRA抗AS作用的具體機制尚未清楚。

TGF-β1是多功能細胞因子，對炎癥因子具有調節作用。研究發現TGF-β1作用于血管平滑肌細胞從而影響血管的生成及維持血管壁的正常結構，可逆轉及改善AS[5]。另外，在內皮細胞中，TGF-β1通過抑制黏附因子E-選擇素的表達，從而抑制內皮細胞活化，使淋巴細胞募集減少；抑制巨噬細胞攝取脂肪顆粒，減少泡沫細胞的形成[6]。TGF-β1促使調節性T細胞分化成熟，降低細胞毒性T細胞對正常細胞和組織的殺傷，從而減輕炎癥反應[7]。內皮細胞活化和泡沫細胞的形成是AS早期的表現，可見TGF-β1在AS早期就具有抗AS的作用。

IL-10作為調節性T細胞產生的主要抗炎因子之一，可抑制效應性T細胞、巨噬細胞、肥大細胞等炎癥細胞的激活，在AS進程中同樣發揮了重要作用[8]。

TGF-β1及IL-10的水平上升可抑制致病性的免疫反應激活，抑制AS的發生發展，反之，TGF-β1及IL-10的水平下降可加重AS斑塊內炎癥細胞的浸潤，促炎因子合成增多，增加膠原的降解，加速易損斑塊的形成[9]。前期臨床研究也證實TGF-β1水平降低可加劇AS的進展、頸動脈斑塊的易損性增加，導致腦梗死的發生[10]。

本研究結果表明兔經過高脂飼料飼養12周后，隨著AS的不斷發生發展，AS斑塊形成，模型組血清抗炎因子TGF-β1和IL-10水平明顯下降，Th17細胞分泌的促炎因子IL-6、IL-17水平明顯上升，經過他汀及ATRA的干預治療，血清抗炎因子TGF-β1和IL-10水平明顯升高，Th17細胞分泌的促炎因子IL-6、IL-17水平明顯下降。提示ATRA具有促進AS斑塊內調節性T細胞的聚集，并抑制T細胞向Th17表型的轉化，從而降低效應性T細胞對正常細胞及組織的殺傷，減輕局部的炎癥反應。

本研究還顯示，與他汀類藥物主要通過有效降低LDL-C的水平從而發揮抗AS作用不同，ATRA并未降低血清LDL-C的水平，提示ATRA的抗AS作用不依賴于血脂的改變，主要通過抑制動脈局部的炎癥反應，在AS的不同階段均具有抗AS作用。

綜上所述，ATRA具有抗AS的作用，其機制可能與ATRA提升血清抗炎因子、降低促炎因子水平的炎癥免疫調節作用有關。但炎性因子眾多，炎癥反應復雜，其抗AS作用的確切機制還有待進一步研究。

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(責任編輯：幸建華)

Effect of all-trans retinoic acid on the atherosclerotic plaque and inflammatory response in carotid artery of rabbits

PENG Zhongxing,LI Xiang,DIAO Shengpeng,HUANG Yeqing,CHENG Jing,LIU Aiqun,WEI Zhisheng,YU Qingyun,HONG Mingfan

(DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510080,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of all-trans retinoic acid (ATRA) on the development of atherosclerotic plaque and the expression of TGF-β1,IL-6,IL-10 and IL-17 on the rabbit carotid atherosclerosis model. Method 34 male New Zealand rabbits were randomly divided into four groups,including the normal group,the model group,statin group and ATRA group. The normal group was given basic feed,and other groups were fed with high fat diet. After 4 weeks,rabbits were treated intragastrically with simvastatin D at 2 mg/kg per day or ATRA at 20 g/day. The atherosclerotic plaque and inflammatory response in carotid artery were examined at the end of 12 weeks. Meanwhile,the serum levels of lipids,TGF-β1,IL-6,IL-10 and IL-17 were measured. Result The AS plaque and broken intima were observed in the model groups. The endothelial cell morphology and endometrium were intact in statin- and ATRA-treated groups. Compared with the model group,the levels of TGF-β1 and IL-10 were significantly increased in ATRA group (3 059.49±599.75) and (46.83±4.56)ng/L and statin group (2 709.48±601.44) and(43.13±4.07)ng/L. By contrast,the levels of IL-6 and IL-17 were significantly lowered in ATRA group (64.92±6.64) and (1 474.88±140.55)ng/L and statin group (69.54±8.84) and (1 518.58±136.69)ng/L. Conclusion ATRA ameliorates the development of atherosclerosis in rabbit model,which may be related to reduction of the inflammatory response.

carotid atherosclerosis; all-trans retinoic acid; TGF-β1; inflammation

2016-06-19

廣東藥學院科技處-附屬第一醫院聯合自然科學培育基金項目(GYFYLH201322)

彭忠興，男，碩士，主任醫師，主要從事腦血管病的基礎和臨床研究，Email:pzx802@163.com。

時間：2016-10-21 11:10:58

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161021.1110.001.html

R965

A

1006-8783(2016)05-0639-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016061902