搜風祛痰中藥對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化不穩定斑塊自噬相關蛋白beclin1和LC3的影響

倪小鷗，宮麗鴻，張　湜，白光彪

1．遼寧中醫藥大學(遼寧沈陽 110032)，E-mail：18640253400@163．com；2．遼寧中醫藥大學附屬醫院

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搜風祛痰中藥對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化不穩定斑塊自噬相關蛋白beclin1和LC3的影響

倪小鷗1，宮麗鴻2，張湜1，白光彪1

1．遼寧中醫藥大學(遼寧沈陽 110032)，E-mail：18640253400@163．com；2．遼寧中醫藥大學附屬醫院

摘要：目的觀察搜風祛痰法中藥復方穩斑湯對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化(AS)不穩定斑塊自噬相關蛋白beclin1和LC3的影響。方法建立ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化不穩定斑塊模型，并設立空白組、模型組、西藥組及穩斑湯低、中、高劑量組。實驗周期1個月，麻醉處死小鼠取主動脈組織HE染色后在光學顯微鏡下進行病理學觀察，然后采用Western blot法檢測beclin1及LC3的蛋白表達水平。結果beclin-1蛋白表達結果顯示：與空白對照組比較，模型對照組小鼠腹主動脈組織中beclin1蛋白表達水平顯著降低(P<0．01)；與模型對照組比較，中藥中劑量組、中藥高劑量組、西藥組小鼠腹主動脈組織中beclin1蛋白表達水平顯著升高(P<0．01)；中藥高劑量組與西藥組無統計學意義(P>0．05)。LC3蛋白表達結果顯示：與空白對照組比較，模型對照組小鼠腹主動脈組織中LC3蛋白表達水平顯著降低(P<0．01)；與模型對照組比較，中藥各劑量組及西藥組小鼠腹主動脈組織中LC3蛋白表達水平顯著升高(P<0．01)；中藥高劑量組與西藥組無統計學意義。結論搜風祛痰法中藥復方穩斑湯對于beclin1與LC3的蛋白表達密切相關，即搜風祛痰法中藥復方穩斑湯可能通過影響beclin1與LC3的蛋白表達，從而影響動脈粥樣硬化斑塊的穩定性。

關鍵詞：動脈粥樣硬化；搜風祛痰中藥復方；穩斑湯；ApoE基因敲除小鼠；不穩定斑塊；自噬相關蛋白；beclin1；LC3

動脈粥樣硬化(AS) 是由于動脈血管內膜出現了黃色的膽固醇、類脂肪，逐漸血栓形成，纖維組織增生及鈣質沉著，日久出現動脈管壁鈣化。AS疾病普遍存在內皮功能障礙，成為導致或加重AS的重要因素之一[1]。在由AS所導致的疾病或與之相關的疾病中，對疾病的預后和死亡率有著非常重要的關系。AS斑塊普遍認為分成：內皮細胞損傷、脂質條紋形成及纖維斑塊和復合斑塊三步。AS斑塊的發生發展受遺傳和環境多種因素影響[2]。細胞利用溶酶體途徑實現過多或衰亡的細胞器及損傷蛋白的降解即為自噬[3]。作為自噬相關蛋白的Beclin1 和LC3 均是參與自噬體形成的重要基因，Beclin1 是自噬特異性基因，而微管相關蛋白1 輕鏈31( LC3) 是自噬標志性基因，是自噬特異的診斷指標之一[4]。本實驗以ApoE基因敲除小鼠為研究對象，給予中藥復方穩斑湯，觀察自噬基因becl- in1和LC3的蛋白表達情況，推斷二者對動脈粥樣硬化斑塊穩定性的影響。

1材料與方法

1．1實驗動物(6～8)周齡ApoE基因缺陷鼠(系C57BU6 J，北京大學實驗動物中心美國Jackson實驗室引進并培育成功)70只，SPF級，體質量18 g～20 g。

1．2藥物穩斑湯藥物組成：全蝎10 g，蜈蚣2條，地龍15 g，陳皮15 g，法半夏15 g，白術15 g，水蛭15 g。由遼寧中醫藥大學附屬醫院中藥局提供，加工制成含生藥2 g/mL的中藥濃縮液備用。

1．3試劑和儀器Beclin-1，LC3一抗及相對應二抗購自北京博奧森生物科技有限公司；總蛋白提取試劑盒北京天恩澤生物科技有限公司；蛋白marber(北京索萊寶生物科技有限公司)；ECL發光試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)。

1．4模型制備高脂飼料(含0．15%膽固醇)喂養13周后，隨機處死4只。取主動脈根部，HE染色觀察AS硬化程度，確定造模成功。

1．5分組及給藥取60只ApoE基因敲除小鼠，隨機抽取12只，建立模型組。隨機抽取4組治療組，每組12支建立穩斑湯低劑量組、穩斑湯中劑量組、穩斑湯高劑量組及西藥組。按成人服用量，換算小鼠(小鼠的體質量折算系數9．0折算)用量。穩斑湯低劑量組61．75 g/(kg·d)，穩斑湯中劑量組123．5 g/(kg·d)，穩斑湯高劑量組247 g/(kg·d)，西藥組予阿托伐他汀0．27 g/(kg·d)，模型組給予生理鹽水0．3 mL/d。按體質量系數比折算成小鼠用量灌胃給藥，每日1次。各組干預時間為1周。另隨機取正常C57BL/6J小鼠12只正常飼料喂養13周，設為空白組。處死全部小鼠，無菌條件下取出主動脈凍存于-80℃冰箱中備用。

1．6觀察指標①主動脈組織病理學觀察。每組隨機取10只小鼠，麻醉處死，無菌條件下在每只小鼠的主動脈根部取4個相同的切面。切面分別為：升主動脈近端橫截面，切面形態呈圓形；主動脈瓣附著部位，并有冠狀動脈開口：主動脈瓣起始橫截面；主動脈瓣完全出現并匯合在一起。取材后用生理鹽水沖洗，10%甲醛中性溶液固定。常規石蠟包埋，均勻間斷切片，厚5 μm。①HE染色：普通光鏡下觀察主動脈根部組織及斑塊的形態結構。②將組織從冰箱中取出，融化，按照組織凈重與裂解液1∶10加入蛋白提取試劑，并用玻璃勻漿器在冰上進行勻漿，勻漿后靜置于冰上20 min，10 000 r/min進行離心，離心15 min，分離上清液即為總蛋白備用。采用考馬斯亮藍法對各組總蛋白進行蛋白定量，每孔上樣20 μg總蛋白進行電泳，半干轉印法將蛋白轉至PVDF膜，一抗(1∶200)4℃孵育過夜、二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，ECL發光，膠片曝光，掃描膠片，分別測定目的蛋白和內參β-actin條帶灰度值，并用目的蛋白灰度值/內參灰度值的比值表示該目的蛋白表達水平，進行統計分析。

2結果

2．1腹主動脈組織HE染色結果根據以往實驗得出ApoE基因敲除小鼠腹主動脈組織HE染色在光鏡下觀察結果，空白對照組動脈內膜附有一層內皮細胞，內皮細胞層呈現皺褶狀排列，但排列均勻，表面光滑，未見泡沫細胞及炎性細胞；模型對照組：血管腔內可見明顯的粥樣硬化斑塊出現，斑塊表面附有纖維帽，纖維帽主要由平滑肌細胞、彈力纖維和膠原組織構成，斑塊中央可見大量的脂質聚集，斑塊內可見大量泡沫細胞，偶見炎性細胞浸潤，未出現斑塊的動脈內膜區域嚴重破損；穩斑湯低劑量組：血管腔內可見粥樣硬化斑塊，斑塊面積明顯小于模型對照組，斑塊內脂質含量較模型組少，斑塊內可見少量泡沫細胞及炎性細胞，未出現斑塊的動脈內膜區域形態較為完整，偶見內膜殘缺；穩斑湯中劑量組、穩斑湯高劑量組、西藥組：動脈內膜大部分較為光滑，偶見內膜不全，內膜不全區域可見明顯的脂質條紋塊形成，偶見泡沫細胞聚集，有少量纖維成分交聯。

2．2各組小鼠腹主動脈組織中beclin1的表達水平(見表1、見圖1)與空白對照組比較，模型對照組小鼠腹主動脈組織中beclin1蛋白表達水平顯著降低(P<0．01)；與模型對照組比較，中藥中劑量、中藥高劑量、西藥組小鼠腹主動脈組織中beclin1蛋白表達水平顯著升高(P<0．01)；與西藥組比較，中藥高劑量組小鼠腹主動脈組織中beclin1蛋白表達水平無顯著變化(P>0．05)。

表1　各組小鼠腹主動脈組織中beclin1

注：1為空白對照組；2為模型對照組；3為低劑量組；

2．3各組小鼠腹主動脈組織中的LC3蛋白表達水平(見表2、圖2)與空白對照組比較，模型對照組小鼠腹主動脈組織中LC3蛋白表達水平顯著降低(P<0．01)；與模型對照組比較，中藥各劑量組及西藥組小鼠腹主動脈組織中LC3蛋白表達水平顯著升高(P<0．01)；與西藥組比較，中藥高劑量組小鼠腹主動脈組織中LC3蛋白表達水平無統計學意義。

表2　各組小鼠腹主動脈組織中LC3蛋白表達水平(±s)

注：1為空白對照組；2為模型對照組；3為低劑量組；

3討論

冠狀動脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎。Ross等[5]指出AS是一種炎性疾病，自噬相關蛋白在AS的發生發展過程中具有重要作用。自噬蛋白可影響感染性疾病及炎癥性疾病的病理過程，而且在非細菌感染相關的組織損傷所誘發的炎癥反應中也能發揮抗炎效應[6]。自噬還能夠抑制動脈粥樣硬化的發生和發展。已有的研究結果較一致認為自噬對粥樣硬化具有保護作用[7]。通過自噬清除細胞內的損傷成分，保護細胞抵御各種應激，防止細胞發生凋亡和壞死。

Beclin-1 基因是第一個被研究的自噬基因，對自噬體的形成至關重要[8-9]；微管相關蛋白LC3 是哺乳動物細胞中酵母自噬相關基因8(ATG8)的同源物，LC3 的表達含量與自噬泡含量數的多少呈正相關，因此，LC3被認為是自噬體的標志分子，可作為檢測機體自噬程度的基因檢測物，近來研究發現，ox-LDL 能夠誘導血管內皮細胞自噬，導致微管相關蛋白LC3 和Beclin-1 表達增加，在過量膽固醇存在的情況下，LC3Ⅱ蛋白含量明顯升高，大量自噬泡聚集，自噬的抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)明顯抑制由膽固醇負荷所誘導的自噬，促進動脈粥樣硬化的發生[10-11]。本研究結果表明，與空白對照組比較，模型對照組小鼠腹主動脈組織中beclin1蛋白、LC3蛋白表達水平顯著降低，該結果與以往研究結果一致，說明動脈粥樣硬化發生時，可引起beclin1蛋白、LC3蛋白表達水平的降低。而中藥各劑量組與西藥組均能不同程度的提高beclin-1蛋白、LC3蛋白的表達，進而提高自噬相關蛋白的活性。這說明上調自噬相關基因beclin-1 蛋白和LC3 蛋白的表達，可以增強機體的抗氧化作用，進一步減少血管內脂質的浸潤，阻止氧化應激反應的進展從而預防動脈粥樣硬化的形成及發展。本實驗觀察到搜風祛痰中藥復方穩斑湯干預后ApoE基因敲除小鼠體內自噬相關基因beclin-1蛋白和LC3蛋白的表達有所增加，血管內粥樣斑塊的脂質浸潤明顯減少，斑塊更趨穩定。

從古到今，眾醫家認為胸痹是由于氣虧，痰濁，瘀血，氣滯，寒凝而引起心脈痹阻不暢而至。而這些是從病理機制而言，所以胸痹存在痰濕、陰虛及血瘀等臨床分型。這些分型只不過是在胸痹發展過程中的不同病理階段或是所表現的側重點不同。本研究主要從痰、瘀、熱三方面兼夾轉化的病理基礎為點，探討治療方法。中醫學認為心氣不足，推動無力，心陰失養，陽微而陰弦，痰瘀阻絡脈道不利，而更主要的是三者雜合，交結為患，日久不化，釀成濁脂，浸于脈管。所謂“陽微”，是指胸陽不足，所謂“陰弦”，是痰飲阻滯。《醫學心悟》曰“其人臟腑素有郁熱，則風乘火勢，火借風威，熱風悱郁不得宣泄，而為熱風矣”。本實驗選用本院經驗方復方穩斑湯，方用全蝎、蜈蚣、地龍共為君藥，以達熄風止痙、解毒散結，通絡止痛平喘之功。 以陳皮、半夏、白術為臣，既能燥濕化痰又可寬胸理氣、消痞散結；水蛭破血逐瘀，為佐藥。共奏搜風祛瘀，通絡散結之功效。

干預 beclin-1與LC3的蛋白表達將成為防治 AS的新靶點。本實驗結果表明搜風祛痰中藥復方穩斑湯與西藥阿托伐他汀鈣片治療AS的效果具有相同作用，搜風祛痰中藥復方穩斑湯可以提高beclin-1與LC3的蛋白表達，這可能是搜風祛痰中藥復方穩斑湯增強粥樣動脈硬化斑塊穩定性的機制之一。

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(本文編輯王雅潔)

Effects of Expelling Wind to Eliminate Phlegm Methed on the Expression of Beclin-1 and LC3 in ApoE Gene Knockout Rats with Atherosclerosis Unstable Plaque

Ni Xiaoou，Gong Lihong，Zhang Shi，Bai Guangbiao

Lingning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，Liaoning，China

Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Wenban decoction(WBD) with the function of expelling wind to eliminate phiegm beclin-1 and LC3 in ApoE gene knockout rats with atherosclerosis(AS)on unstable plaque．Methods Six to eight weeks old ApoE gene-deficient rats were selected to establish AS unstable plaque modle，and then they were given low-dose，medium-dose，high-dose WBD and western medicine for a month．At the same time，the modle group was fed by normal saline for one month．Then aortic tissue was under optical microscope pathology after Hematoxylin and Eosin (HE) staining．And then levels of beclin-1 and LC3 were detected by western blot technique．ResultsBeclin-1 expression levels in aortic tissue of rats in middle-dose WBD group，high-dose WBD group and western medicine group was significantly higher than those in control group，the differences were statistically significant(P<0．01)．LC3 expression levels in aortic tissue of rats in treatment groups was significantly higher than those in control group，the differences were statistically significant(P<0．01)．ConclusionWBD with the function of expelling wind to eliminate phiegm can influence the expression stability of atherosclerotic plaque by regulating beclin1 and LC3 protein．

Key words：atherosclerosis；expelling wind to eliminate phiegm treatment；Wenban decoction；ApoE grne knockout rats；unstable plaque；autophagy；beclin-1；LC3

(收稿日期：2015-11-25)

中圖分類號：R285

文獻標識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．05．012

文章編號：1672-1349(2016)05-0488-04

基金項目：中國博士后基金面上項目(No．20110491540)；遼寧省百千萬人才項目(No．2011921022)；遼寧省自然基金項目(No．2014020055)

·基礎醫學論著/研究·