大鼠急性胰腺炎的免疫變化與Treg及IL-35表達的相關性①

由昭陽，楊　沙，田　樺，卓　越

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

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大鼠急性胰腺炎的免疫變化與Treg及IL-35表達的相關性①

由昭陽，楊沙，田樺，卓越

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：探討Treg及IL-35在大鼠急性胰腺炎模型中的變化及意義。方法：36只S-D大鼠分為正常組(6只)和AP組(30只)，后者結扎膽總管造模成功后分別在2、6、12、24、48h處死，每次6只大鼠。流式細胞儀測定外周血中CD4+CD25+T細胞占淋巴細胞的百分比，ELISA法測定血IL-35水平。胰腺損傷程度根據參照吳建新[6]等的方法進行病理評分。結果：與對照組[(2.70±0.13)%]相比，AP各組Treg的比例在2、6，12、24、48h時明顯下降(P<0.05)。IL-35水平在2、6、12、24、48h明顯下降，與對照組(1.04±0.12pg/mL)相比,各組有統計學意義(P<0.05)。相關性分析提示Treg百分比與IL-35水平呈明顯正相關。結論：大鼠急性胰腺炎模型調節性T細胞與IL-35水平均呈下降趨勢。

關鍵詞：急性胰腺炎;免疫變化;Treg;IL-35

研究顯示AP病程中往往呈現免疫應激與免疫抑制先后并存、交替失衡的病理生理改變。有學者發現AP時外周血CD3+、CD4+T細胞數目及CD4+/CD8+比值下降，同時產生多種炎性介質及細胞因子引起機體免疫系統失衡，進而感染增加，多器官臟器衰竭[1]。而免疫系統自身又具有一定的自我調節功能，Treg就是具有負向免疫調控作用的淋巴細胞亞群[2,3]。IL-35也可以直接或間接地發揮免疫抑制作用[4]。本實驗通過建立大鼠急性胰腺炎模型，行胰腺病理學評分，檢測外周血Treg百分比及IL-35水平，初步探討急性胰腺炎早期大鼠Treg及IL-35的變化及可能作用。

1材料與方法

1.1實驗動物

S-D大鼠(n=36), 成年雄性，平均體重200g，佳木斯大學動物實驗中心提供。

1.2實驗主要試劑及儀器

LX-200掌式離心機(海門市麒麟儀器廠),流式細胞分析儀 FACScalibur(美國BD公司)，CD4抗體、CD25抗體(金山橋公司)，大鼠白細胞介素35ELISA試劑盒(上海諾源公司),-80℃度超低溫冰箱(日本Sanyo 公司),YBL-2 生物組織包埋機,HM-315 組織切片機。

1.3動物實驗模型制備與標本采集

1.3.1模型制備

本實驗采用膽總管末端結扎法制備急性胰腺炎模型[5]，大鼠隨機分為對照組(6只)及AP組(30只),其中AP組在造模后2、6、12、24、48h處死，每次處死6只大鼠。方法：兩組實驗動物均在同等條件下給予正常飼料和高溫滅菌自來水喂養，4周后，平均體重200g，實驗前禁食12h(正常飲水),將水合氯醛等比稀釋后，向大鼠腹腔注射麻醉。將麻醉后的大鼠固定于手術臺上。皮膚消毒，沿腹正中線切開直至腹部肌層，進入腹腔，將皮膚及肌層牽向兩側。尋找大鼠的胃，沿胃下端十二指腸端尋找十二指腸大乳頭及膽總管末端，游離膽總管末端，用細線在膽總管末端結扎，關腹。正常組，正常飲食及飲水。根據胰腺水腫，白細胞浸潤、出血和壞死程度病理評分，參照吳建新[6]等的方法評定造模是否成功。

1.3.2標本收集

造模成功后的2h、6h、12h、24h、48h時大鼠下腔靜脈采血5mL存于真空抗凝管中3000r/min離心15min。取上清液置于-80℃凍存。取胰腺組織，在福爾馬林溶液中固定48h后常規石蠟包埋。對照組采用同樣方式處理。

1.4觀察指標

1.4.1胰腺組織病理形態學觀察及評分

取胰腺組織置于福爾馬林中固定，經過脫水、石蠟包埋透明和封片后，用蘇木素-伊紅染色，觀察胰腺病理改變。由佳木斯大學病理教研室病理醫師觀察切片。胰腺組織病理評分參照吳建新[6]等的方法。

1.4.2Treg百分比及IL-35水平測定

全血標本在肝素抗凝下經稀釋、破紅、洗滌及淋巴細胞分離后分別加CD4抗體和CD25抗體(中山金橋公司)，在試管中混勻，避光孵育20min后，將試管放入流式細胞儀，上機測定，CD4+CD25+的細胞為Treg，以均數±標準差表示。

IL-35測定采用標準酶聯免疫吸附試驗，抗體由上海諾源公司提供。按照試劑盒說明書執行。

1．5統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件，統計學分析將得到的數據進行轉換，統計檢驗結果表明其轉換值服從正態分布，利用方差分析進行組間比較；相關性分析采用Pearson相關分析法，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

血Treg及IL-35變化及其與病理評分相關性血Treg變化：各組Treg百分比平均水平在對照組為2.706%，而在AP各組均小于2%，在誘導AP后2 h時平均為1.735%，隨著時間推移，Treg水平有下降趨勢，到48 h達最低即0.744%。而統計結果顯示AP各組Treg水平均較對照組顯著降低(P<0.05)，見表1。Il-35變化：對照組為(1.04±0.12)pg/mL實驗組2h(0.74±0.17)pg/mL，之后為下降趨勢，直至48h最低值(0.31±0.11)pg/mL且P<0.05,見表1。

病理評分：通過肉眼觀及光鏡下觀察，2h時最小值為3.23,至48h最大值為15.06，總體呈上升趨勢。外周血Treg與IL-35呈正相關(Pearson相關性=0.398, P<0.05),兩者與胰腺病理評分均呈負相關(Pearson相關性=-0.869及-0.407, P均<0.05)。

表1　外周血Treg、IL-35水平及胰腺病理

注：與對照組相比，#P<0.05,*P<0.05,^P<0.05。

3討論

AP的發病是由多種機制共同作用的結果，其中免疫平衡失調占有重要地位。本實驗結果顯示，實驗組中Treg呈逐漸降低(P<0.05),相關性分析提示Treg對急性胰腺炎有顯著影響。既往研究表明，CD4+CD25+Treg細胞是具有免疫抑制作用的負向調控細胞，其免疫抑制作用有多種方式，其中最重要的方式是IL-2奪獲[7]。IL-2作用于T淋巴細胞，使其增殖，而Treg上的CD25為IL-2受體α鏈，能與效應細胞競爭結合IL-2，Treg細胞消耗IL-2,導致IL-2這種細胞因子增殖緩慢，抑制了T細胞的迅速增長，由于在急性胰腺炎的初始階段應為促炎反應占主導優勢，隨著疾病的發展，由促炎轉變為抗炎，進而抑制免疫反應，抑制IL-2的力度是逐漸降低的，相對應的，T淋巴細胞的激活程度是逐漸升高的。這正與本實驗Treg在實驗組2h中所占淋巴細胞百分比最多，而隨著時間的推移，Treg所占百分比是下降的趨勢這一結果相符合。由此推測Treg所占百分比降低可能是急性胰腺炎早期免疫過度激活的機制之一。這與丁震[8]等研究結果類似。但丁震等研究中Treg在6小時后出現顯著降低，這較遲于本實驗的下降時間，考慮系本實驗選取結扎膽總管的造模方式有關。

實驗中發現隨著大鼠急性胰腺炎的進展IL-35的含量是呈下降趨勢的(P<0.05),同時胰腺病理評分逐漸增高，相關性分析提示IL-35對急性胰腺炎有影響(P<0.05)。這也符合我們現階段對IL-35的認識，有研究表明IL-35可通過抑制淋巴細胞增殖作用降低炎性細胞因子的表達[9，10]，表明其在炎癥過程中可能具有負向調節作用,另外，另一種由外周CD4+CD25+Treg細胞激活形成的iTreg細胞可分泌IL-35，而IL-35反過來對iTreg有正反饋作用[2]。在急性胰腺炎前期機體對于炎癥的保護性反饋作用；至后期，機體釋放出大量的致炎性細胞因子，抑炎性細胞因子的表達受到抑制，故IL-35的表達水平出現明顯降低。

綜上所述，血清IL-35 和外周血Treg百分比在大鼠急性胰腺炎模型不同階段存在差異，可能在急性胰腺炎發生、發展過程中發揮重要作用。大鼠急性胰腺炎IL-35 和Treg 細胞亞群的檢測，更能使我們正確、充分、全面地了解急性胰腺炎的發病機制和免疫變化，從而更有效地指導臨床治療。

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(收稿日期：2015-11-21)

中圖分類號：R576

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)01-0037-02

(作者簡介：由昭陽(1988～)女，黑龍江七臺河人，在讀碩士研究生。(通訊作者：田樺(1969～)女，黑龍江佳木斯人，雙學士,副主任藥師，碩士研究生導師。E-mail:zhuoyuejsmu@126.com。

基金項目:1.佳木斯大學研究生創新科技課題，編號:LM2015_025;2.黑龍江省自然科學基金面上項目，編號：H2015072。