奧卡西平對戊四氮致癲大鼠腦組織內MMP-2、MMP-9表達的干預作用①

孟勝男，金玉玲

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

?

奧卡西平對戊四氮致癲大鼠腦組織內MMP-2、MMP-9表達的干預作用①

孟勝男，金玉玲

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：通過戊四氮建立大鼠致癲模型，研究奧卡西平(oxcarbazepine，OXC)對大鼠腦組織內MMP-2與MMP-9表達的干預情況。方法：采用SD雄性大鼠(SPF級)，隨機分為正常組、戊四氮致癲組以及戊四氮致癲加高中低濃度奧卡西平組。正常組給予生理鹽水、戊四氮組給予35mg/kg劑量，戊四氮加奧卡西平組高劑量200mg/kg、中劑量100mg/kg、低劑量組50mg/kg。記錄大鼠行為學情況及大鼠疲勞儀上停留時間，應用Real-time PCR方法分析MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達量在各組間含量的差異。結果：用戊四氮制備的大鼠癲癇模型，MMP-2與MMP-9表達明顯上調，在奧卡西平灌藥3周起就能夠顯著降低MMP-2與MMP-9表達，并且呈現劑量相關性。RT-PCR結果表明正常組的MMP-9與MMP-2的mRNA與蛋白表達水平都處于較低的水平，當注射戊四氮后，MMP-2與MMP-9明顯上調(P<0.01，P<0.01)，當灌注不同劑量的奧卡西平之后，MMP-9與MMP-2的表達明顯下調，200mg/kg奧卡西平組已接近正常組水平。結論：奧卡西平通過對大鼠腦組織內MMP-2、MMP-9表達的干預，對戊四氮致癲大鼠腦組織結構和功能具有保護作用，此保護作用具有劑量相關性。

關鍵詞：奧卡西平；戊四氮致癲大鼠；MMP-2表達；MMP-9表達

癲癇是腦部的一種慢性疾患,是一組由大腦神經元高度同步化異常放電所引起的短暫中樞神經系統功能失常為特征的腦部疾病[1]癲癇至今尚無根治的方法，因此癲癇的治療成為國內外研究的重點[2]基質金屬蛋白酶(MMPs)是Zn2+和Ca2+依賴性蛋白水解酶。MMPs能催化降解細胞外基質所有成分。MMPs家族中MMP-2、MMP-9的作用較為重要，并且在中樞神經系統神經元中MMP-2、MMP-9高度表達。研究發現MMP-9通過降解基底膜,破壞血腦屏障(BBB)[3~7]。另外有文獻報道在戊四氮致癲模型大鼠中，大腦組織發生嚴重損傷，血腦屏障通透性降低，同時發生炎癥性損傷[8~12]。奧卡西平(OXC是新型抗癲癇藥物，本實驗通過戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)來建立大鼠癲癇模型，同時通過檢測MMP-9與MMP-2的表達情況。發現正常組MMP-9與MMP-2的表達低，注射戊四氮后MMP-9與MMP-2明顯上調，而奧卡西平能夠下調這種表達，間接為癲癇機制的闡明提供理論依據。

1材料和方法

1.1實驗動物分組

220～250g SD品系大鼠(SPF級，大連醫科大學實驗動物中心提供)，實驗條件為室溫，正常晝夜更替，24h供應食水。

1.2主要試劑

MMP-2 (72kD,66kD) 單克隆兔抗體，MMP-9 (92kD,82kD,78kD) 單克隆兔抗體，PCR提取及逆轉錄試劑盒試劑盒等。

1.3制備模型、分組給藥方案及行為學觀察

220～250g SD品系大鼠40只，隨機分成5組，每組8只。稱取戊四氮(PTZ)1g,加入生理鹽水100mL,溶解，按照35mg/kg標準分別給戊四氮組以及不同濃度奧卡西平組注射，而正常組只注射等量的生理鹽水。按照 Racine分級，對照組以及不同濃度奧卡西平組達到三級以上癲癇發作三次，視為戊四氮點燃成功，點燃成功后戊四氮隔日一次相同劑量，用來維持癲癇效應。奧卡西平組按照高劑量(200mg/kg)、中劑量組(100mg/kg)、低劑量組(50mg/kg)一日兩次灌胃。時間一共3周。戊四氮組及奧卡西平藥物組無死亡。

Racine 分級法：0 級：無任何反應；1 級：胡須抖動，面肌抽動；2 級：點頭、咀嚼或濕狗樣抖動；3 級：一側前肢抬起，陣攣；4 級：站立伴有雙側前肢陣攣；5 級：跌倒，全身強直陣攣性發作，或抽搐致死。

實驗結束后， 全部大鼠通過斷頭處理， 用鍘刀迅速切取大鼠頭部， 將頭腦放置冰上， 用咬骨鉗撥快速開顱骨， 從中取出全部的腦組織， 以備后續實驗。

1.4RT-PCR檢測

組織內總RNA的提取，逆轉錄合成cDNA ，然后PCR擴增經同源比對后確定引物序列，MxPro-Mx3000P軟件分析，對PCR的結果進行處理。

1.5統計學方法

2結果

2.1奧卡西平對大鼠行為學變化的影響

實驗中我們觀察到戊四氮組大鼠有明顯的癲癇發作，表現出前肢震顫等行為學障礙，在大鼠疲勞儀(Rota-Rod)上的停留時間顯著減少(圖1,A，***表示P<0.01)，給予50mg/kg奧卡西平即能夠得到一定的改善，隨著奧氮平給藥劑量的增加，停留時間逐漸增加(#、##、###均表示與戊四氮組的比較)，當奧卡西平達到200mg/kg時，大鼠在疲勞儀上的停留時間與正常對照組一樣(N.S.表示無統計學意義)，說明奧卡西平就能夠顯著改善行為學障礙，大幅度的減少癲癇的發作次數和每次發作的持續時間。并且呈現劑量相關性。各組大鼠體重(圖2)沒有明顯的變化,說明奧卡西平不會影響體重，副作用較小，具有使用價值。

圖1　大鼠疲勞儀(Rota-Rod)上的停留時間

圖2　大鼠體重變化

圖3　不同組大鼠組織中MMP-2,MMP-9的mRNA水平表達

2.2RT-PCR結果

發現正常對照組MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白水平的表達量很低，戊四氮作用組顯著升高(P<0.01，P<0.01)，應用奧卡西平治療后降低，接近正常對照組水平(圖3)。

3討論

MMP-2與MMP-9主要分布于人體的神經組織中，參與了神經元的黏附與識別、軸突、樹突的分支與生長以及形成神經元環路的過程，它們在腦損傷后的突觸重建和軸突再生過程中發揮了重要作用。同時近年來有許多研宄表明基質金屬蛋白酶家族參與癲癇的發生，在發生癲癇時，體內會過度上調MMP-2與MMP-9的表達，可能就會導致異常的神經元的形成，繼而此異常神經元發生異常放電。有研究表明，發育中的大腦拮抗癲癇發作所致的突觸重建，發育中大腦有一種自我保護機制[13，14]奧卡西平(OXC)是新型抗癲癇藥物，它的機制可能是下調MMP-9與MMP-2的表達，從而導致星形膠質細胞的活化被抑制，神經元細胞的壞死以及重建異位突觸，從而減輕大腦損傷，由PTZ慢性致癲癇造成的。而MMP-9與MMP-2具體關系有待進一步研究。這種神經保護作用奧卡西平在一定程度與劑量具有線性相關性，大劑量使用OXC可能會影響幼鼠生長。因此，我們需要更加準確的尋找最佳的安全劑量。在臨床上應該積極尋找最佳劑量。RT-PCR結果表明正常組的MMP-9與MMP-2的mRNA與蛋白表達水平都處于較低的水平，當注射戊四氮后，MMP-2與MMP-9明顯上調(P<0.01，P<0.01)，當灌注不同劑量的奧卡西平之后，MMP-9與MMP-2的表達明顯下調，200mg/kg奧卡西平組已接近正常組水平。奧卡西平通過對腦組織內MMP-2、MMP-9表達的干預改善戊四氮致癲大鼠腦的結構和功能，并且具有劑量相關性。

參考文獻：

[1]呂艷婷,王淑秋,宋立德,等.靈芝抱子粉對戊四氮致大鼠大腦皮質及海馬區PCNA變化的影響[J].黑龍江醫藥科學,2010,33(l):37-38

[2]單鶴，陸曉紅，王國輝,等.戊四氮慢性致癇大鼠海馬區PPARrmRNA的表達及神經細胞損傷的影響[J].黑龍江醫藥科學,2014,37(2)：86-87

[3]Jin K，Peel AL，Mao XO，et al．Increased hippocampal neurogenesis in Alzheimer's disease[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2010，101：343-347

[4]吳丹紅，鐘萍，包關水,等．不同劑量托吡酯對癲癇大鼠海馬組織中NCAM 和GAP-43mRNA 表達的影響[J]．上海交通大學學報(醫學版)，2009，29(12)：1459-1462

[5]王藝，李智平，施黃．戊四氮點燃大鼠慢性癲癇模型的建立及評價[J]．復旦學報，2006，33(2)：206-208

[6]Racine RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulationⅡ：Motor seizure, Electroencephalogr [J]．Clin Nerophysiol，1972，32(3)：281-294

[7]Sarkisian MR. Overview of the current animal models for human seizure and epileptic disorders[J]．Epilepsy Behav，2001，2(3)：201-216

[8]Goddard GV．Development of epileptic seizures through brain stimulation at low intensity[J]．Nature，1967，214：1-9

[9]Klioueva IA，Luijitelear EL，Chepurnova NE，et al．PTZ-induced seizures in rat：effects of age and strain[J]．Physio & Behavior，2001，72(3)：421-426

[10]Plans A M，Soriano M A，Ferrer I，et al．Regional expression of inducible heat shock protein 70 mRNA in the rat following administration of convulsant d-rugs[J]．Mol Brain Res，1994，27：127-137

[11] 張輝，隋鴻錦．海馬結構的細胞構筑[J]．醫學綜述，2003，9(11)：683-689

[12] Jin K, Peel AL, Mao XO, et al．Increased hippocampal neurogenesis in Alzheimer's disease[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2010，101：343-347

[13]Imamura S，Tanaka S，Akaike K，et al．Hippocampal transection attenuares kaini-acid-induced amygdalar seizures in rats[J]．Brain Res，2001，897(1-2)：93-103

[14]David WC，Bin X，Racine R J，et al．Chronic lithium treatment inhibits pilocarpine-induced mossy fiber sprouting in rat hippocampus [J]. Neuropsychopharmacology，2003，28：1448-1453

The effects of oxcarbazapin on expressions of MMP-2,MMP-9 in chronic epilepsy rats induced by pentylenetetrazole

MENGSheng-nan,JINYu-ling

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003,China)

Abstract:Objective: To Study MMP-2 and MMP-9 expression in the brain tissue by establishing epileptic rat model using oxcarbazepine (oxcarbazepine, OXC).Methods: The subjects with SD male rats (SPF grade) were randomly divided into normal group, pentylenetetrazol pentylenetetrazol epileptic group and low concentration oxcarbazepine group. Normal saline group were given pentylenetetrazole 35mg/kg dose level. Pentylenetetrazole group were given pentylenetetrazole 35mg/kg dose level, and concentration oxcarbazepine group were given oxcarbazepine the dose of 200mg / kg, the dose of 100mg / kg, the low-dose group 50mg / kg. The residence time on the case and the fatigue behavior of rats instrument rats were recorded. MMP-2, MMP-9 mRNA and protein expression differences in content between the groups were analyzed by real-time PCR .Results:Epileptic rat model was established by using oxcarbazepine (oxcarbazepine, OXC). MMP-2 and MMP-9 expression were significantly upregulated in three weeks. Body weight and food intake of rats in each group did not change significantly. MMP-2, MMP-9 express after the application of oxcarbazepine treatment were reduced to near normal levels in the control group. The brain structure has been basically removed. RT-PCR results showed that in normal group, MMP-9 mRNA and protein expression levels of MMP-2 were at a low level. MMP-2 and MMP-9 were significantly increased (P < 0.01, P <0.01). With the injection pentylenetetrazol, MMP-9 and MMP-2 expression were significantly reduced. 200mg /kg oxcarbazepine group was close to normal levels with using different doses of oxcarbazepine.Conclusions: MMP-2, MMP-9 expression in the rat brain have a protective effect to brain structure and function by oxcarbazepine intervention with injecting pentylenetetrazol. This protective effect relate to dose.

Key words:oxcarbazapin;chronic epilepsy rat;MMP-2;MMP-9

(收稿日期：2015-04-18)

中圖分類號：R742.1

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)01-0064-03

作者簡介：孟勝男(1985~)女，黑龍江哈爾濱人，在讀碩士研究生。通訊作者：金玉玲(1969~)女，黑龍江佳木斯人,碩士，主任醫師,碩士研究生導師。E-mail:jyl2017@sina.com。