BRAF基因突變與結直腸腺癌病理及臨床預后的意義①

伍　潔，柳風序 ，李雪欣，姚海濤

(1.牡丹江市第二人民醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157013；2．佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

?

BRAF基因突變與結直腸腺癌病理及臨床預后的意義①

伍潔1，柳風序2，李雪欣2，姚海濤2

(1.牡丹江市第二人民醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157013；2．佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

摘要：目的:BRAF基因突變對結直腸腺癌病理及臨床治療的意義。方法:收集我院 2014年1~12月經病理科診斷手術的166例原發(fā)結直腸腺癌組織標本及61例癌旁正常組織。用PCR-DNA直接測序法檢測BRAF突變情況。結果:①癌組織中BRAF基因突變率9.04%，常見類型BRAF-V600E，癌旁正常組織無基因突變。②癌組織分級低突變率較組織分級高的患者突變率高，癌組織有淋巴轉移患者BRAF基因突變率較無轉移患者的高，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。③癌組織BRAF基因突變率與患者性別、年齡、發(fā)病部位無相關性(P>0.05)。有遠處轉移的患者BRAF基因突變率比無遠處轉移的明顯增高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論:結直腸癌患者中，癌組織BRAF基因突變率明顯高于旁正常組織，與癌組織的分化程度、淋巴轉移有相關性，有器官轉移的患者BRAF基因突變多見，提示與患者腫瘤轉移有關，預后不良。

關鍵詞:BRAF基因；結直腸癌；病理；臨床預后

各地資料顯示隨著人民生活水平提高，飲食結構改變，結直腸癌成為消化道常見的惡性腫瘤，我國CRC患者發(fā)病率以每年3.9%速度遞增，已經占惡性腫瘤的第3位，患者確診后5年存活率僅為55%左右[1]。很多研究證實了RAS-BRAF-MAPK細胞信號轉導通路激活與惡性腫瘤的發(fā)病、進展和惡性程度密切相關。原癌基因BRAF蛋白作為一種基因編碼的絲/蘇氨酸特異性激酶，是該通路細胞內重要信號轉導因子,使腸道凋亡誘導因子失活造成細胞過渡增殖，促進組織分化、血管生成和侵襲轉移等導致惡性腫瘤的發(fā)生[2]。隨著對CRC發(fā)病分子的生物學機制和基因突變的不斷深入研究，靶向藥物治療有效降低了患者死亡率提高生存質量的同時，也出現(xiàn)了臨床耐藥[3]。大量臨床證實KRAS、BRAF基因突變患者在抗EGFR靶向治療中無效，預后生存差，只有BRAF基因野生型患者才能從抗EGFR單克隆抗體治療中獲益[4]。BRAF基因是否成為臨床耐藥和不良預后的預測性指標，與療效及預后的關系尚有爭議[5]，本文旨在探討術后的結直腸腺癌組織中BRAF基因突變情況與臨床病理的相關性，并分析其對臨床治療和預后的影響，以下為研究過程回顧。

1材料與方法

1.1材料

收集我院2014年1~12月經病理科診斷手術166例原發(fā)結直腸癌腺癌組織標本及其癌旁正常組織(距腫瘤邊緣<5cm)61例作為對照組。年齡19～76歲，平均(49.9±10.1)歲。患者術前均未行放、化療。

1.2實驗方法

1.2.1組織DNA分子提取：DNA小量抽提試劑盒(純化柱式)購自碧云天生物技術研究所[6]。對病例癌組織、癌旁正常組織石蠟標本切8μm厚10張水展后用膜片撈出，同時切取4μm厚一張，行HE染色顯微鏡下觀察腫瘤細胞集中區(qū)域。采用激光共聚焦切割儀選取對應區(qū)域將切片上腫瘤組織歸入0.5mLEP管中脫蠟醇化，加入細胞裂解液55℃水浴過夜，50μL蛋白酶K消化，沉淀洗鹽，-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫颖拘袧舛取⒓兌葴y定稀釋后行PCR檢測。

1.2.2PCR產物擴增純化：由上海碧云天生物技術有限公司利用軟件Premier5.0設計PCR引物序列如下：BRAF基因第15號外顯子：上游引物5'-CTCTTCCATAATGCTTGCTCTGATAGG-3'下游引物5'-GTGAGAAAAATAGCCTCAATTCTTACC-3'擴增片段長度為318bp。PCR反應體系50μL，反應條件為：95℃預變性 5min；94℃ 變性30s；60℃退火 30s，72℃延伸 60s，共30個循環(huán)；最后72℃ 延伸10min；降至4℃結束反應。于美國BIO-RAD 580BR PCR儀器上進行基因擴增。用純化試劑盒將PCR產物純化。取5μLPCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，紫外燈下檢測觀察，照相存盤。

1.2.3DNA分子直接測序：將檢測有單一條帶的樣本送公司測序，測序結果經人工校對記錄后用DNAMAN6.0軟件對測序圖譜分析，與基因庫BRAF基因序列比較總結結果。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用χ2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1癌組織中B-RAF基因突變率為(15/166)9.04%。癌旁正常腸組織無基因突變。15外顯子上突變類型有6種：常見突變類型為BRAF-V600E(11/15)，有1例第014號標本是多位點串聯(lián)突變。見表1。

表1　結直腸癌BRAF基因15外顯子突變類型

2.2癌組織BRAF基因突變組織分級低12.09%(11/91)的患者較組織分級高5.33%(4/75)患者突變率高，兩者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.79，P<0.05)。有淋巴轉移患者12.37% (13/97)突變率較無轉移2.90%(2/69)患者突變率高，兩者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.85，P<0.05)。 見表2。

表2　癌組織中BRAF基因突變狀態(tài)與臨床病理相關性

2.349例有遠處器官轉移的患者BRAF基因突變率14.29%(7/49)比無轉移的患者突變率6.84%(8/117)增高顯著，因(χ2=2.74，P>0.05)無統(tǒng)計學意義。癌組織中患者性別(χ2=3.65，P>0.05)、年齡(χ2=3.58，P>0.05)、發(fā)病部位(χ2=2.82，P>0.05)、浸潤深度(χ2=1.94，P>0.05)的BRAF基因突變率與生存無相關性。 見表2。

3討論

本研究檢測癌組織中BRAF基因突變率(15/166)9.04%，符合目前文獻BRAF基因突變率約4%～13%[7]。15例BRAF基因突變患者中有93.33%(14/15)為第600個脫氧核苷酸突變， BRAF-V600E突變有11例為常見突變類型。癌組織分化程度低(χ2=6.79，P<0.05)、有淋巴轉移患者BRAF基因突變率高(χ2=5.85，P<0.05)。由于大多數(shù)病人術后3～5年會有復發(fā)轉移風險，腫瘤分化程度越低、有淋巴轉移提示患者腫瘤惡性程度越高、分期都較晚復發(fā)轉移風險大。早期檢測KRAS、BRAF等基因突變情況指導臨床用藥[8]。結直腸癌患者術后的生存不排除受腫瘤的病理類型、分期和治療手段、藥物敏感程度、心態(tài)因素、經濟條件、個體差異等諸多因素影響，實驗證實BRAF基因突變患者藥物治療效果差，生存時間短[3]。遠處轉移患者中BRAF基因突變率14.29%(7/49)比無轉移的患者突變率6.84%(8/117)增高顯著，提示與腫瘤轉移有關，由于有遠處轉移屬于晚期患者即使進行原發(fā)灶和轉移灶手術治療，患者復發(fā)轉移風險高治療效果差預后不良[4]。差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.74,P>0.05)。目前研究認為腫瘤的發(fā)生由復雜的網絡系統(tǒng)調控，所有信號通路之間存在相互交叉，破壞其中某一通路可使得信號轉導從這個網絡中其它的通路進行，阻斷一個受體或者激酶就能阻斷任何信息傳導是不客觀的。說明除了BRAF基因外NRAS、CRAF基因及P13K/AKT、RalGDS途徑等也可以調控EGFR信號通路激活形成腫瘤。沒有一種腫瘤只存在一個治療靶點, 往往是多個位點同時起作用, 也是目前臨床靶向治療耐藥的主要原因[3]。開發(fā)多靶點藥物和細胞毒藥物聯(lián)合用藥，隨著患者生存時間延長，藥物的毒副作用也明顯，生存質量得不到提高，患者因不能耐受藥物反應、經濟負擔沉重而放棄用藥，是目前CRC死亡率居高不下的主要原因。因此隨著BRAF基因臨床耐藥和不良預后的預測性指標相關研究不斷深入發(fā)展[9]，如何阻斷BRAF/MAPK信號通路對結直腸癌患者的治療和預后的影響仍需進一步探討。

綜上所述, BRAF基因突變研究短短幾年，目前的基因檢測手段及分子靶向治療藥物費用昂貴，為了減輕患者經濟負擔，提高靶向治療效果，希望本研究能促進結直腸癌患者在選擇治療方案前早期檢測相關基因狀態(tài)，同時做好藥敏試驗，為臨床用藥提供準確理論依據(jù)[10]，相信未來靶向藥物更加合理地應用臨床，腫瘤的個體化治療真正由理想變?yōu)楝F(xiàn)實，造福于廣大結直腸癌患者。

參考文獻：

[1]陸萬青，張思維，曾紅梅.中國2010年惡性腫瘤發(fā)病與死亡[J].中國腫瘤，2014，23(1):1-10

[2]Hoshino R, Chatani Y, Yamori T, et al. Constitutive activation of the 41- /43- kDa mitogen-activated protein kinase signaling path-way in human tumors[J].Oncogene, 2011, 18(3):813-822

[3]李森朋，張岫美，張芮. BRAF基因突變與腫瘤耐藥[J].藥學研究，2013，32(8):470-472

[4]涂金花，余英豪. 基因突變與結直腸癌靶向治療的新進展[J].世界華人消化雜志，2012，20(16):1447-1452

[5]曹洪超，張成武，竇拉加.Braf基因在結直腸癌的靶向治療及預后判斷中的作用[J] .社區(qū)醫(yī)學雜志，2011，9(12):39-41

[6]尹相林，展秀君，沈萍，等.人外周血DNA提取方法比較[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2014，37(16):47-48

[7]Liou JM，Wu MS，Shun CT，et al.Mutations in BRAF correlate with poor survival of colorectal cancers in Chinese population[J].Int J Colorectal Dis，2011，26(11):1387-1395

[8]熊慧，張阿偉，范貴民，等.K-RAS和DCC在直結腸癌中的表達及意義[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2014，37(2):53-54

[9]Yan GR，Xu ZJ，Wang HY，et al．Progress of antitumor study based on BRAF[J] .Yao Xue Xue Bao，2012, 47(12):1567-1574

[10]衛(wèi)生部病理質控中心，結直腸癌BRAF基因突變檢測專家組. 結直腸癌BRAF基因突變檢測專家共識[J].中華病理學雜志，2012，41(9):635-646

The significance of BRAF genetic mutations with pathological and clinical prognosis in colorectal cancer patients

WUJie1,LIUFeng-xu2,LIXue-xin2,YAOHai-tao2

(1.The Second People’s Hospital, Mudanjiang 157013，China; 2. The Basic Medical School, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

Abstract：Objective：To study the correlation about the expression of BRAF genetic mutations with clinical pathological in colorectal cancer patients; and to analyze its significance of clinical treatment and prognosis.Methods：166 samples of colorectal adenocarcinoma tissues and 61samples of normal tissues adjacent to carcinoma were selected from affiliated hospitals of Jiamusi University during 2014. The PCR-DNA direct sequencing method is used to detect the BRAF genetic mutations situation in intestinal tissues. Results：①Among colorectal cancer patients, there were 9.04%(15/166) BRAF genetic mutations rates. BRAFV600E is mutation type of Common . Normal intestinal tissue adjacent to carcinoma was no BRAF genetic mutations. ② The mutations rates of BRAF genetic in cancer tissues of tissues low differentiation are higher than that of high differentiation (P<0.05). The lymphatic metastasis mutations rates of BRAF genetic in cancer tissues were higher than no metastasis (P<0.05). ③ The mutations rates of BRAF genetic have no relationship with gender, age, primary cancer location，infiltration depth, clinical stage and distant metastasis(P>0.05). Conclusion：In colorectal cancer patients, the cancer tissues have BRAF genetic mutations, and normal intestinal tissue adjacent to carcinoma was no BRAF genetic mutations. The situation of BRAF genetic mutations in colorectal cancer has correlation relationship with cancerous tissues differentiation degree and lymph node metastases. The BRAF genetic mutationsin cancer tissues of distant metastasis are higher than those with no metastasis. There are some relationship the patients with tumor metastasis，with prompt poor prognosis.

Key words:BRAF genetic; colorectal cancer; pathological；clinical prognosis

(收稿日期：2015-05-14)

中圖分類號：R735.3+5

文獻標識碼：B

文章編號：1008-0104(2016)01-0069-03

作者簡介：伍潔(1973～)女，黑龍江牡丹江人，碩士，副主任醫(yī)師。主要從事消化道腫瘤及內科治療研究。通訊作者：姚海濤(1964～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導師。E-mail:jmsdxyht1228@163.com。

注：柳風序為佳木斯大學在校本科生。