恩替卡韋聯合逍遙散對肝纖維化腫瘤壞死因子TNF-α的影響①

王慶生，李紹民，馮　瀾

(佳木斯大學附屬第一醫院 傳染病科，黑龍江 佳木斯 154003)

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恩替卡韋聯合逍遙散對肝纖維化腫瘤壞死因子TNF-α的影響①

王慶生，李紹民，馮瀾

(佳木斯大學附屬第一醫院 傳染病科，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：采用硫代乙酰胺(TAA)誘導的大鼠肝纖維化模型進行實驗研究，觀察恩替卡韋聯合逍遙散抗肝纖維化作用，對該方抗肝纖維化的可能作用機理進行研究。方法：SD雄性大鼠30只，隨機分為肝纖維化模型組、恩替卡韋治療組和恩替卡韋聯合逍遙散治療組。為大鼠皮下注射TAA，每周注射2次，連續注射至第6周，形成肝纖維化。藥物治療組于造模第7周開始，每天給予逍遙散水煎液8g/kg灌胃，每周恩替卡韋0.5mg/kg灌胃，6周后用腹腔注射麻醉大鼠后從眼球靜脈叢取血收集血清。對模型組和治療組的生化指標ALT和AST進行檢測，利用放免試劑盒進行酶聯免疫吸附試驗(ELISA法) 檢測血清中TNF-α。結果：與模型組相比，治療組顯著降低了血清AST/ALT的活性，TNF-α濃度有明顯降低。結論：恩替卡韋聯合逍遙散可有效抑制促肝纖維化細胞因子TNF-α的表達，其機制可能與恩替卡韋聯合逍遙散阻斷纖維化形成過程中細胞因子的網絡傳遞有關。

關鍵詞：恩替卡韋聯合逍遙散；肝纖維化；腫瘤壞死因子TNF-α；硫代乙酰胺

肝纖維化是對各種慢性刺激的愈合反應，包括乙型肝炎病毒感染、代謝紊亂、酗酒和自身免疫性對肝臟的攻擊。肝纖維化是肝硬化的前兆，是所有慢性肝病向肝硬化發展的重要病理進程，肝纖維化和肝硬化的產生和發展是多種類型的細胞、細胞因子和核糖核酸參與的結果。活化肝星狀細胞(HSC)是肝纖維化的發生發展中的關鍵事件和膠原沉積的一個主要因素。HSC活化的特點是細胞增殖和遷移，收縮后轉化成肌成纖維細胞，生成大量膠原蛋白和其他細胞外基質(ECM)，最終導致肝纖維化。在分子水平上，多種細胞因子參與調解HSC的活化和纖維化形成的信號通路調節。在抑制HBV復制以罕見的耐藥突變和它的安全在慢性肝炎和肝硬化患者，恩替卡韋治療實踐的研究證實了其有效性。恩替卡韋作為一種強效的抗病毒藥物在慢性病毒性肝炎的治療中應用廣泛，其抗病毒活性較其他核苷類似物強許多倍，且具有更好的抑制病能力，而長期應用并不會產生明顯的耐藥性，尤其適合肝纖維化的抗病毒治療。一系列的中藥抗肝纖維化的實驗研究也相繼展開[1~2]，逍遙散為經典古方，治療慢性乙型肝炎中醫理論明確，驗之臨床療效顯著，同時臨床上廣泛用于肝纖維的防治。目前中西藥物聯合應用的作用機制不清楚，本文試圖在恩替卡韋功效和現代臨床應用經驗的基礎上，聯合逍遙散，對采用硫代乙酰胺(TAA)誘導的大鼠肝纖維化模型進行實驗研究，觀察恩替卡韋聯合逍遙散抗肝纖維化作用，并初步探討其作用機制，為臨床應用恩替卡韋聯合逍遙散中西醫結合治療肝纖維化提供更多的科學依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

實驗動物：清潔級SD雄性大鼠30只(由佳木斯大學實驗動物中心提供)，體質量(220~250)g。

主要實驗試劑：丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒，購自南京建成生物工程研究所，腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒，購自上海森雄科技實業有限公司。TAA購自天津市大茂化學試劑廠，逍遙散處方飲片(購自北京同仁堂制藥集團哈爾濱藥店)制成逍遙散水煎液，濃度為2g/mL，為生藥量，恩替卡韋片劑(中美上海施貴寶公司)。

1.2動物模型制備與分組給藥

SD雄性大鼠30只，把大鼠隨機分為3組，每組各10只，即空白對照組、模型組恩替卡韋聯合逍遙散治療組。空白對照組在常溫下自由攝取食物和飲水，適應性飼養7d后進行實驗。其余兩組大鼠皮下注射濃度為0.03%的TAA生理鹽水溶液 200 mg/kg，每周注射2次，連續注射至第6周，形成肝纖維化，6周造模給藥結束后，提取血清，并于-40℃中保存。藥物治療組于造模第7周開始，每天給予逍遙散水煎液8g/kg灌胃，每周恩替卡韋0.5mg/kg灌胃，6周治療結束后，提取血清以備檢測。

1.3觀察指標

1.3.1臨床生化指標檢測

對大鼠進行眼眶靜脈叢取血，采集模型組和治療組大鼠的血清，分離血清，按照試劑盒的說明對ALT和AST進行濃度測試。

1.3.2細胞因子的檢測

采集模型組和治療組大鼠的血清，利用放免試劑盒進行酶聯免疫吸附試驗(ELISA法)，嚴格按照試劑盒所示方法檢測所提取的大鼠血清中的TNF-α含量。

1.4統計學方法

2結果

2.1一般情況

造模期間大鼠體質量的增加明顯慢于實驗前。正常對照組肝臟無任何病理異常，具有明顯的肝細胞的板塊，竇狀小管和中央靜脈，肝細胞多邊形有保存完好的胞質明顯的細胞核。造模完成后，TAA模型組顯示肝僵硬、腫脹與粗糙，表面上有顆粒狀或結節狀改變，類似于人類的嚴重肝纖維化，表現出正常結構的損失，炎癥和阻塞與細胞質空泡化的跡象，脂肪變化，血竇擴張。與TAA對照組相比，治療組表現出更少纖維結節，尤其恩替卡韋聯合逍遙散聯合治療組的肝臟顯示平滑的表面和不結節狀改變，正常的肝結構，最小肝細胞結構的破壞，保存完好的胞漿，很小的纖維化膠原隔膜和低淋巴細胞浸潤。這些觀察的改變都表明恩替卡韋聯合逍遙散聯合治療的有效性。

2.2模型組和治療組大鼠ALT，AST含量

模型組與治療組血清中ALT和AST含量變化，見表1。TAA模型組顯著上調了血清AST/ALT，而治療組顯著降低了血清AST/ALT的活性。

表1　大鼠血清ALT和AST含量變化

注：與空白對照組比較，*P<0. 05；與模型組比較，**P < 0. 05。

2.3模型組和治療組大鼠肝組織中TNF-α濃度變化

模型組與治療組大鼠肝組織中TNF-α濃度變化,見表2。與模型組比較，治療組中TNF-α含量顯著降低。

表2　大鼠血清TNF-α濃度變化

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，**P<0.05。

3討論

肝臟是代謝和解毒的重要器官，肝纖維化以細胞外基質(ECM)過度沉積為特點，是由于生物因素或化學藥物對慢性或反復性肝損傷的一種創傷愈合反應[3]。肝纖維化導致一系列的慢性炎癥性疾病，包括病毒性肝炎、酒精飲料和非酒精性脂肪性肝炎免疫損傷、原發性膽汁性肝硬化等[4]。慢性炎癥后膠原蛋白逐漸積累，它包括肝細胞和循環免疫細胞產生細胞因子的驅動。由于這些炎癥刺激，狄氏間隙中的靜態星狀細胞激活類肌成纖維細胞分泌膠原蛋白。膠原蛋白和其他細胞外基質分子的積累遠遠超過從駐留和巨噬細胞浸潤釋放金屬蛋白酶降解。持續的傷害，無論是門戶域或中央靜脈周圍纖維化的發展最初，最終形成橋接纖維化結節形成厚厚的纖維組織帶包圍，最終導致肝硬化。扭曲的結構肝硬化門靜脈高壓癥導致并發癥、減少肝細胞功能和肝癌的風險。因此，肝纖維化早期診斷和預防可以有效地防止肝硬化及其并發癥。盡管現代醫學取得了巨大進展，但還沒有滿意的治療方法或治療肝病藥物[5]。因此，開發新的藥物保護作用已變得更為重要和緊迫[6]。

在我們的實驗中，與恩替卡韋聯合逍遙散治療組相比，TAA模型組有顯著的減少體重與肝、脾重量顯著增加，這可以歸因于在整個實驗期間TAA的毒性效應。這被認為是最可靠和一致的癥狀在實驗動物中的毒性。治療組大鼠的體重正常的增加表明了其安全性。治療組中，肝臟切片相對輕微的發炎和輕微空泡變性，而大部分區域無明顯變化。組織病理學檢查也表明了TAA所致纖維恢復良好。TAA大鼠肝臟顯示脂肪變性、壞死，治療組有顯著減少纖維化的程度，這可能是由于減少大鼠星狀細胞浸潤。TAA介導的肝纖維化模型是一種非常有效、可靠和令人滿意的實驗肝損傷模型[7]。TAA介導的肝纖維化是造成自由基介導的脂質過氧化作用。在慢性TAA中毒過程中，大量肝纖維化和突出的再生結節發展為相關的肝硬化門脈高壓癥和高動力循環特性。這一點體現在其組織病理學分析和生化參數(ALT、AST等)上。AST/ALT是細胞中的轉氨酶，這是常規肝損傷的敏感指標[8]。增加的AST/ALT水平表明肝細胞中的一種炎癥狀態，它可能導致肝纖維化[9]。TAA干擾RNA從細胞核與細胞質的運動，造成膜損傷，結果了增加肝臟血清標志物的釋放。在我們的實驗中，TAA模型組顯著上調了血清AST/ALT，而治療組顯著降低了血清AST/ALT的活性。治療組生化指標水平的明顯改善，表明恩替卡韋聯合逍遙散對保護肝臟起到了有益的影響。

在分子水平上，多種細胞因子參與調解的信號通路調節HSC的活化和纖維化形成。細胞因子及氧化應激被認為是導致纖維化，結果導致星狀細胞的激活。TNF-α主要是由單核細胞、巨噬細胞，肝星狀細胞和、Kupffer細胞產生。它對這些細胞有促炎癥反應活動和毒效應。肝纖維化的過程中，腫瘤壞死因子-α在HSC的活化和細胞外基質ECM的合成中起重要作用。通過上調抗凋亡因子NF-кB，Bcl-XL和p21，以及下調凋亡信號因子P53，TNF-α可以減少自發性激活大鼠HSC的凋亡。然而，腫瘤壞死因子α對HSCs和纖維化的影響是復雜的。在NASH動物模型中，腫瘤壞死因子-α信號通過激活KCs肝纖維化發病機制中起著至關重要的作用[10]。與模型組比較，治療組中TNF-α含量顯著降低，提示恩替卡韋聯合逍遙散對肝纖維化具有顯著地預防和治療作用，其機制可能與減少TNF-α的釋放，抑制HSC的活化，在轉錄和翻譯水平干預HSC中基因的表達有關。實驗獲得的所有數據表現出較強的初步證據，恩替卡韋聯合逍遙散對TAA誘導的肝纖維化具有保護作用，因此，可作為有效的中西醫結合方法對化學性肝損傷起到有效的預防和治療作用。

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The effect of entecavir combined with xiaoyao powder on tumor necrosis factor TNF-α with hepatic fibrosis in rat

WANGQing-sheng,LIShao-min,FENGLan

(The Department of Infectious Diseases, the First Affilliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China)

Abstract:Objective: To investigate the antifibrotic effect of entecavir combined with Xiaoyao power on thioacetamide (TAA)-induced rat hepatic fibrosis. Methods: The 30 rats were randomly divided into three groups: nomal control group, model group and treated group. Thioacetamide (TAA) (300 mg/kg body weight) was injected intraperitoneally 2 times a week into model group and treated group for 6 weeks to form liver fibrosis. Group3 were treated with entecavir (0.5mg/kg) combined with Xiaoyao power (8g/kg) by gastric perfusion for six weeks. The changes of plasma biochemistry and TNF-α were measured with the methods of biochemistry and ELISA. Results: The treatment with entecavir combined with Xiaoyao power restored the biochemical parameters (ALT/AST) towards normal. The level of TNF-α was significantly lower in the treated group compared to the model group. Conclusion: Entecavir was combined with Xiaoyao powder which can effectively inhibit the expression of hepatic fibrosis-promoting cytokines TNF-α. Entecavir combined with Xiaoyao may be block the network transmission of cytokines in the formation of fibrosis.

Key words:entecavir combined with xiaoyao power; hepatic fibrosis; tumor necrosis factor TNF-α; thioacetamide (TAA)

(收稿日期：2015-05-10)

中圖分類號：R575.2

文獻標識碼：B

文章編號：1008-0104(2016)01-0084-02

作者簡介:王慶生(1970～)男,黑龍江哈爾濱人,在讀碩士研究生。通訊作者:李紹民(1967～)男,黑龍江佳木斯人,學士，主任醫師,教授,碩士研究生導師。E-mail: hwwqs216@ 126. com。