自噬因子Beclin 1和LC3表達與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性研究

黃俊玲　鐘騰猛　黃贊松　李廣志　周喜漢　何守搞

533000 廣西右江民族醫(yī)學院消化疾病研究所/附屬醫(yī)院(黃俊玲,黃贊松,李廣志,周喜漢,何守搞)；533000 廣西百色市人民醫(yī)院(鐘騰猛)

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自噬因子Beclin 1和LC3表達與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性研究

黃俊玲鐘騰猛黃贊松李廣志周喜漢何守搞

533000 廣西右江民族醫(yī)學院消化疾病研究所/附屬醫(yī)院(黃俊玲,黃贊松,李廣志,周喜漢,何守搞)；533000 廣西百色市人民醫(yī)院(鐘騰猛)

【摘要】目的探討自噬因子Beclin 1和LC3表達與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性。方法采用免疫組織化學方法，檢測胃癌組織中自噬因子Beclin 1和LC3的表達情況。結(jié)果Beclin 1蛋白在胃癌組織中的表達率為42.5%(51/120)，在癌旁組織其表達率為93.3%(112/120)，兩者比較有顯著性差異(χ2=21.3，P<0.05)；LC3蛋白在胃癌組織中的表達率為90.0%(108/120)，明顯高于癌旁組織的表達率(29.3%，34/120) ，兩者有顯著性差異(χ2=24.8，P<0.05)。Beclin 1和LC3蛋白表達與胃癌腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，P<0.05。結(jié)論自噬因子Beclin1和LC3表達可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】胃癌；Beclin 1；LC3

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:530～532)

自噬是細胞死亡的1種形式，不但參與正常的生理反應，而且參與各種病理學過程[1]。但是自噬因子與胃癌病理相關(guān)性研究目前知之甚少，有待進一步研究[2-3]。本研究用免疫組化方法檢測自噬因子在胃癌組織中的表達分布，探討自噬因子在癌變過程中的作用以及臨床意義。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器

免疫組化所用單克隆抗體均購于CST公司，免疫組化試劑盒購于康成生物科技有限公司，顯微成像系統(tǒng)購于Leica公司。

1.2標本及切片準備

從2010年至2013年，我院共收治120例胃癌患者，切取120例患者的癌組織及癌旁組織，患者均未行任何化療、放療或腫瘤其他療法。所有標本均采用石蠟切片法進行處理和切片，每個標本做連續(xù)切片2張，每張厚約5 μm，均行HE染色。

1.3免疫組織化學染色

①石蠟切片常規(guī)脫蠟后用酶消化處理，然后水化，用0.01 mol/L pH 7.2～7.4,PBS洗5 min，冷風吹干，放入濕盒中。②滴加稀釋的抗體，37 ℃ 30～60 min或4 ℃ 過夜。③PBS 洗2次，蒸餾水洗1次。④50%甘油緩沖液封片。⑤熒光顯微鏡下檢查。⑥對照染色。陽性對照，用已經(jīng)證實的含有靶抗原的組織切片與待檢標本同樣處理，結(jié)果應為陽性。陰性對照，用確知不存在靶抗原的組織切片與待檢標本同樣處理，結(jié)果應為陰性。空白對照，用免去特異性抗體或用PBS替代特異性抗體，結(jié)果應為陰性。抑制試驗，將標記抗體和未標記的抗體或血清等量混合后，按上述步驟處理切片，結(jié)果應為陰性(一步法)。或?qū)⒋龣z切片兩張，一張加未標記特異性血清，另一張加未標記同種正常血清，孵育后沖洗，再加入標記的特異性血清(例如特異性熒光標記抗體)，加了未標記特異性血清的切片因抗原抗體已結(jié)合，故染色被抑制，呈陰性結(jié)果，而加同種正常血清的切片則呈陽性反應(二步法)。切片標本經(jīng)自來水充分沖洗后，蘇木精復染細胞核，梯度乙醇脫水后，用二甲苯透明，中性樹膠封片后，顯微鏡下觀察并拍照。

1.4陽性結(jié)果判斷標準

采用半定量評分對結(jié)果進行判定，在低倍鏡和高倍鏡下觀察全片，根據(jù)染色強度和染色細胞所占比率的乘積來判定。染色強度(A)可以分為不染色、淡黃色、黃色、棕黃色。在×400高倍鏡下至少任意計數(shù)5個視野，觀察陽性染色細胞程度并準確計數(shù)。陽性染色細胞(B)的評分標準：陽性細胞數(shù)≤10%為1分；10%～50%為2分；≥50%為3分。總評分為A與B的乘積。

胃癌前病變包括腺體萎縮、腸上皮化和上皮內(nèi)瘤變。癌前病變和癌變的診斷以病理診斷為金標準。

1.5統(tǒng)計學分析

應用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件處理相關(guān)實驗數(shù)據(jù)，自噬因子的表達與臨床病理學特征的關(guān)系采用χ2檢驗。P<0.01或0.05為具有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1Beclin 1和LC3蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達情況

Beclin 1蛋白在胃癌組織中的表達率為42.5%(51/120)，在癌旁組織中的表達率為93.3%(112/120)，兩者有顯著性差異(χ2=21.3，P<0.05)；LC3蛋白在胃癌組織中的表達率為90.0%(108/120)，明顯高于癌旁組織的表達率(29.3%，34/120) ，兩者比較有顯著性差異(χ2=24.8，P<0.05)。

2.2Beclin 1和LC3蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

Beclin 1和LC3蛋白表達與胃癌分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，P<0.05，見表1。

表1　Beclin 1和LC3蛋白表達與胃癌

3討論

自噬是機體由于自身代謝和某些細胞器更新的緣故，吞噬自身蛋白質(zhì)或細胞器，并被溶酶體融合及降解的過程，是1種正常的、高度保守的細胞功能，與細胞增殖、凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。有很多研究報道表明，與細胞癌變有關(guān)的癌基因和抑癌基因可以受細胞自噬信號通路調(diào)[4-5]。消化性潰瘍常常導致胃癌前病變，是胃癌發(fā)生的重要原因之一，近年來，其發(fā)病率和死亡率都居高不下，引起了社會各界人士的廣泛關(guān)注[6-10]。但是自噬因子與Hp感染導致的消化性潰瘍合并胃癌前病變的相關(guān)性目前并不明確，有待進一步研究。

本研究結(jié)果表明，自噬因子Beclin 1在胃癌中的表達量明顯低于癌旁組織，Beclin1的低表達可能是胃癌前病變發(fā)生的分子生物學機制之一。Beclin 1主要為細胞漿內(nèi)，也稱為BECN1，是迄今為止在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的唯一自噬基因，是酵母自噬相關(guān)基因6(ATG6)的同系物，與多種腫瘤或癌癥的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。自噬性細胞死亡是一種不依賴caspase的Ⅱ型程序性細胞死亡，Beclin 1是與自噬相關(guān)的抑癌基因，是激活自噬信號通路的關(guān)鍵蛋白之一，可以調(diào)控調(diào)往信號通路，誘導癌細胞凋亡。Beclin 1的表達水平與腫瘤或癌癥惡化程度有關(guān)，在臨床上可以作為預測標志物和判斷患者預后的生物學指標。Beclin 1在腫瘤中的生物學機制可能有：①腫瘤細胞受刺激后，線粒體釋放大量凋亡蛋白，啟動自噬來清除受損的線粒體，阻斷了線粒體介導的凋亡信號通路，腫瘤細胞受到保護而存活；②Beclin 1抑制Bcl-2凋亡抑制通路，腫瘤細胞可以無限增殖；③參與自噬的Beclin 1主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，不同的腫瘤組織中，Beclin 1在細胞器中的分布存在很大的差異性，在某些腫瘤中，其表達量雖然高，但是不能發(fā)揮抗腫瘤效果。已有研究報道，Beclin 1在慢性肺萎縮性胃炎、胃癌前病變和胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中的表達量及活性逐漸降低，通過自噬和凋亡通路死亡的病變細胞減少，腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移增加，同時，癌變過程中，基因組極其不穩(wěn)定，癌變概率增加，進一步促進了癌癥的發(fā)生。Beclin 1在胃癌組織中表達量下降，是胃癌發(fā)生的早期事件之一，因此對胃癌的患者檢測Beclin 1的表達水平，可以提高胃癌的早期診斷和預后。

自噬體的形成需要多種蛋白質(zhì)復合體和小分子的參與，其標志性蛋白是LC3(autophagy protein microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)，LC3-Ⅰ的C端被類泛素化酶催化后和PE(phosphatidyl ethanolamine,PE)結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ，該蛋白復合物是檢測自噬現(xiàn)象的標志物[11]。LC3介導的自噬作用在多種胃病中都至關(guān)重要[12]，本研究顯示LC3蛋白在胃癌中的表達率為90.0%(108/120)，明顯高于癌旁組織的表達率(29.3%，34/120) ，兩者有顯著性差異(χ2=24.8，P<0.05)，結(jié)果表明LC3蛋白的高表達可能與胃癌的發(fā)生里面相關(guān)。在隨后Beclin 1和LC3蛋白的表達與疾病臨床病理特征的關(guān)系研究中，我們進一步發(fā)現(xiàn)，胃癌惡性程度高的患者中，Beclin 1表達是呈現(xiàn)降低的趨勢，而LC3蛋白的表達是呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，結(jié)果表明兩者與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

綜上所述，研究自噬因子在胃癌中的作用，有助于研制新的治療方案，使臨床診斷更加準確，提高患者的早期診斷及治療。

參考文獻

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(編輯：吳小紅)

Correlation Study of Expression of Autophagic Factors Beclin 1 and LC3 and Clinicopathological Features in Gastric Cancer

HUANGJunling,ZHONGTengmeng,HUANGZansong,etal.AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalCollegeofNationality,Baise,533000

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of autophagic factors Beclin 1 and LC3 and clinicopathological features in gastric cancer.MethodsBy immunohistochemical method,the expression of Beclin 1 and LC3 in gastric cancer tissues were detected.ResultsBeclin 1 protein expression of gastric carcinoma was 42.5% (51/120),and of adjacent tissues was 93.3% (112/120),there was significant difference (χ2=21.3,P<0.05);LC3 protein expression in gastric carcinoma was 90.0% (108/120),which was significantly higher than that of adjacent tissues (29.3%,34/120),there was significant difference (χ2=24.8,P<0.05).Beclin 1 and LC3 protein expression were closely related to the degree of differentiation and lymph node metastasis,P<0.05.ConclusionThe expression of Beclin1 and LC3 are related to carcinogenesis and development of gastric cancer.

【Key words】Gastric cancer;Beclin 1；LC3

(收稿日期2015-07-06修回日期 2015-12-21)

中圖分類號：R735.2

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)04-0530-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.003