急進高原大鼠視網膜功能變化及白藜蘆醇干預效應研究

黨 鴻，辛曉蓉

(1.青海大學醫學院；2.青海紅十字醫院)

急進高原大鼠視網膜功能變化及白藜蘆醇干預效應研究

黨 鴻1，辛曉蓉2※

(1.青海大學醫學院；2.青海紅十字醫院)

目的 建立大鼠急性低壓缺氧模型，探討急進高原大鼠視網膜形態學變化及白藜蘆醇對大鼠視網膜低氧損傷的保護作用及機制。方法 將54只健康SD大鼠隨機分成3組：常氧對照組、低氧模型組、低氧+白藜蘆醇干預組。常氧對照組大鼠在常氧環境下正常喂養(西寧，海拔2260 m)，低氧模型組及低氧+白藜蘆醇干預組大鼠置于低壓氧艙內(模擬5000 m的海拔高度)，每日持續24 h。白藜蘆醇干預組每日腹腔注射白藜蘆醇(30 mg/kg，每日1次)。7 d后剝離視網膜。HE染色，光鏡下觀察大鼠視網膜組織形態；酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定大鼠視網膜組織中過氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)的活性。RT-PCR方法檢測低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)mRNA表達。結果 與常氧對照組相比，光鏡下低氧模型組大鼠視網膜形態發生明顯變化；低氧模型組大鼠視網膜組織中GSH-PX活性顯著下降(P<0.05)，SOD活性有所下降，但差異無統計學意義(P>0.05)，HIF mRNA表達量顯著增加(P<0.01)；低氧+白藜蘆醇干預組GSH-PX、SOD活性有所下降，HIF mRNA表達量輕度減少，差異無統計學意義(P>0.05)。與低氧模型組相比，低氧+白藜蘆醇干預組GSH-PX活性增強(P<0.05)，SOD活性升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；HIF mRNA表達量明顯減少(P<0.01)。結論 急性低壓缺氧環境影響大鼠的視網膜功能，而白藜蘆醇對此損傷有干預作用，可能與其增強SOD與GSH-PX的酶活性，增強對自由基的清除以及調節HIF的表達有關。

急性缺氧 大鼠視網膜 損傷 白藜蘆醇 保護 機制

視網膜作為中樞神經系統的延伸組織，對缺氧極其敏感，急進高原地區易影響視網膜功能。白藜蘆醇(resveratrol，Res)為多羥基芪類化合物，是一種具有抗病及保健功能的非黃酮類多酚化合物，是植物產生的一種天然抗毒素，具有抗缺血性損傷作用[1～2]。有研究表明，Res通過保護人晶狀體上皮細胞能防止氧化損傷性白內障的發生[3]。 Challa等[4]的研究發現Res作為一種有效的抗氧化劑，通過激活FoxO通路對視網膜脫落大鼠的光感受器細胞起保護作用。本實驗通過模擬海拔5000 m的缺氧環境，觀察高海拔缺氧環境對大鼠視網膜形態學與相關指標的影響以及Res對此損傷是否具有保護作用，并對其作用機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性清潔級SD大鼠54只[實驗動物許可證號 SCXK(陜)2012—003，西安交通大學動物實驗中心，體質量(210±20)g]。

1.2 主要試劑與儀器

白藜蘆醇購自北京博奧拓達科技有限公司，大鼠超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)和大鼠谷胱甘肽-過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒購自武漢華聯科生物科技有限公司，人淋巴細胞分離液購自達科為生物技術有限公司，RNAiso Plus、RNA逆轉錄試劑盒購自TAKARA公司，SYBR GREEN kit、384孔RT-PCR板、RT-PCR反應膜購自ABI公司，RT-PCR引物購自上海生工生物工程有限公司；酶標分析儀購自深圳雷杜生命科學股份有限公司，高速低溫離心機購自Sigma公司，生物安全柜購自Thermo公司，低速自動平衡離心機購自湖南湘儀離心機儀器有限公司，熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物造模

將大鼠隨機分成3組：常氧對照組(n=18)、低氧模型組(n=18)、低氧+白藜蘆醇干預組(n=18)。常氧對照組大鼠在常氧環境下正常喂養(西寧，海拔2260 m)，低氧模型組及低氧+白藜蘆醇干預組大鼠置于低壓氧艙內(模擬5000 m的海拔高度)，每24 h開艙0.5 h給大鼠加食、喂水，并給低氧+白藜蘆醇干預組大鼠腹腔注射白藜蘆醇(30 mg/kg，每日1次)，低氧模型組大鼠注射等量生理鹽水，持續7 d。

1.3.2 視網膜組織切片觀察

分離完整視網膜置于4%多聚甲醛中固定，固定視網膜充分展開，勿擠壓與冷凍，待固定充分后用石蠟包埋組織，切片后進行HE染色，光學顯微鏡下觀察視網膜組織改變。

1.3.3 視網膜組織中GSH-PX、SOD活性測定

各組大鼠不同處理7 d后，腹腔注射10%水合氯醛0.35 mL/100 g，麻醉后快速取出眼球，去除晶狀體與玻璃體，并完整剝離視網膜。用無菌PBS溶液作為勻漿介質，在冰浴中充分勻漿，制成10%勻漿液，低溫離心機離心(3500 r·min-1)15 min，取上清液再用無菌的PBS溶液稀釋成1%組織勻漿液，采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定SOD、GSH-PX的含量，具體操作按照超氧化物歧化酶(SOD)和大鼠谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-PX)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒說明進行。用酶標儀450 nm波長依序測量各孔的吸光度，繪制標準曲線，計算視網膜組織GSH-PX、SOD的含量。

1.3.4 低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)的mRNA表達量檢測

各組大鼠不同處理7 d后，腹腔注射10%水合氯醛0.35 mL/100 g，麻醉后快速摘出眼球，沿角膜緣做切口，環形剪除角膜，去除晶狀體與玻璃體，完整剝離視網膜，加1 mL RNAiso Plus混勻，提取細胞總RNA，按照SYBR GREEN kit試劑盒進行RT-PCR實驗。HIF引物序列：forward：5′-GCTGCCTCTTCGACAAGCTT-3′，reverse：5′-CGCTGGAGCTAGCAGAGTCA-3′；Action引物序列forward：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，revesre：5′-TTTAATGTCACGCGATTTC-3′逆轉錄合成cDNA，將獲取的cDNA別加入HIF引物的反應體系中行RT-PCR實驗。以cDNA產物為模板，PCR的循環參數：50 ℃反轉錄3 min，95 ℃初始PCR活化3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環40次。擴增后進行溶解曲線分析、數據的定量分析。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各組視網膜組織切片比較

光鏡下常氧對照組大鼠視網膜組織結構清楚，各層組織結構清晰，神經節細胞單層排列，細胞核較大，呈橢圓形(圖1A)。低氧模型組大鼠視網膜神經感覺層出現水腫，尤其以神經纖維層為著，神經節細胞腫脹(圖1B)，低氧+白藜蘆醇干預組神經節細胞腫脹較低氧組明顯減輕(圖1C)。

A：常氧對照組； B：低氧模型組； C：低氧+白藜蘆醇干預組

2.2 各組SOD、GSH-PX活性對比

與常氧對照組相比，低氧模型組大鼠視網膜組織中GSH-PX活性顯著下降(P<0.05)，低氧+白藜蘆醇干預組GSH-PX活性有所下降，但差異無統計學意義(P>0.05)；低氧模型組和低氧+白藜蘆醇干預組的大鼠視網膜組織中SOD活性均有所下降，但差異無統計學意義(P>0.05)。與低氧模型組相比，低氧+白藜蘆醇干預組GSH-PX活性升高(P<0.05)，SOD活性亦輕度升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組中GSH-PX、SOD活性水平

※：與常氧對照組對比差異有統計學意義(P<0.05)，△：與低氧模型組對比差異有統計學意義(P<0.05).

2.3 視網膜組織HIF mRNA的表達

與常氧對照組對比，低氧模型組的HIF mRNA表達量增加(P<0.01)，低氧+白藜蘆醇干預組HIF mRNA表達量減少，但差異無統計學意義(P>0.05)。與低氧模型組對比，低氧+白藜蘆醇干預組HIF mRNA表達量明顯減少(P<0.01)。見表2。

表2 HIF mRNA在各組中的表達

※：與常氧對照組對比差異有統計學意義(P<0.01)，△：與低氧模型組對比差異有統計學意義(P<0.01).

3 討論

高原是海拔超過2500 m，能引起人體各種生理、病理改變的地域[5]。低壓低氧是高原地區主要的致病因素，視網膜作為中樞神經系統的延伸組織，對缺氧非常敏感，急性缺氧能使視網膜發生一系列病理生理變化。Andreas等[6]檢測了暴露于高原缺氧環境中人的視網膜電流圖(electroretinogram，ERG)發現高原缺氧可通過損傷光感受器的后信號通路而使光感受器功能受損，從而影響視功能。我們前期探討了缺氧對包繞視神經腦膜的重要細胞成分-視神經腦膜上皮細胞的影響，研究提示視神經腦膜上皮細胞作為腦脊液-視神經屏障的主要組成細胞，對缺氧及其敏感，缺氧可導致腦膜上皮細胞活性下降，線粒體功能異常，有可能成為誘導視神經病變發生的病理基礎[7]。本研究我們進一步探討缺氧對中樞神經系統的延伸組織視網膜的影響。

光鏡下觀察各組大鼠視網膜，課題組發現缺氧模型組視網膜神經感覺層出現水腫，尤其以神經纖維層為著，神經節細胞腫脹。由于內層視網膜組織血供來源于視網膜中央動脈，對缺氧反應極其敏感，外層視網膜組織接受脈絡膜毛細血管的血液供應，有較強的缺氧耐受力，故內層視網膜組織在缺氧狀態下形態學變化更為明顯。急性暴露于高海拔缺氧地區可引起機體的氧化應激反應[8]，氧化應激即過量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)蓄積于細胞內，而外源性和內源性抗氧化劑無力清除過多的ROS，從而導致組織發生氧化損傷的過程。視網膜在缺氧狀態下產生大量的ROS，其通過破壞視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells，RGCs)線粒體的功能引起細胞色素C(cytochrome C，CytC)的釋放以及導致熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)的過度表達等途徑誘導RGCs的凋亡[9]。SOD是體內天然的抗氧化劑，能夠清除過多的自由基而阻止機體受自由基損害，GSH-PX是機體重要的抗氧化物酶，是低分子自由基清除劑，具有保護細胞膜的功能。SOD和GSH-PX的活力能夠反映機體的自由基代謝狀況，測定其活力對于了解組織細胞的抗氧化能力具有重要意義。本實驗結果顯示急性缺氧使大鼠視網膜組織的SOD與GSH-PX活性均降低，提示高海拔急性缺氧狀態下視網膜組織中自由基產生過多，消耗了大量視網膜GSH-PX與SOD，視網膜清除自由基能力下降加劇了視網膜的低氧損傷。Res是一種天然的抗毒素，具有抗氧化應激反應作用，抑制炎癥反應，保護腦組織[10]。本實驗中Res干預組大鼠視網膜中GSH-PX活性明顯增強，SOD活性也有所增強，提示Res能通過提高視網膜中抗氧化酶的活性抑制氧自由基的產生，從而減輕低氧應激反應對視網膜的氧化損傷。其作用主要通過增強GSH-PX的活性得以發揮。但Res干預組的視網膜GSH-PX活性依然比常氧對照組的低，說明在臨床應用中單一的Res并不能完全阻止視網膜的低氧損傷，可通過與其他抗氧化物的聯合使用進一步增強其作用。

HIF是一種氧依賴轉錄激活因子，低氧可使其表達明顯增加，進而調節多種基因的表達。HIF能大量活化并激活血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 轉錄，刺激新生血管的形成，參與新生血管相關的角膜、虹膜及脈絡膜病變的病理過程，從而不同程度的影響視功能[11]。也有研究表明HIF通過參與熱休克蛋白的表達誘導視網膜神經細胞的凋亡[12]。本實驗結果顯示急性缺氧使大鼠視網膜HIF的表達增多，而白藜蘆醇干預組可下調其水平，提示Res可通過下調HIF的表達，干預HIF的轉錄調節作用，從而對急性低氧誘導的視網膜損傷起到保護作用，而Res具體影響HIF的作用機制需要進一步研究。

綜上所述，模擬急性高原缺氧環境對大鼠視網膜造成損傷，而白藜蘆醇能通過增強抗氧化酶GSH-PX、SOD的活性，調節HIF的表達對急性高原缺氧誘導的大鼠視網膜損傷有一定的保護作用，但本實驗涉及急進高原大鼠視網膜病變的機制研究較為局限，更多復雜具體的機制有待進一步研究。

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The intervention effects of resveratrol on the retina function changes atsimulated high altitude in rats

DANG Hong1，XIN Xiao-rong2※

(1.Qinghai University Medical College；2.Qinghai Red Cross Hospital)

Objective To investigate the influence of hypobaric hypoxia on the retina by establishing the model of hypobaric hypoxia，and study the protective effects of resveratrol on rat retina hypoxic damage and explore the mechanism involving the pathlogical process.Methods 54 SD rats were randomly divided into the control group，hypoxic group and resveratrol intervention group.The control croup was feeding at 2260 m above sea level，the hypoxia group and the resveratrol intervention group were maintained at low pressure oxygen cabin(simulation for 5000 m above sea level)for a full 24 hours a day.Resveratrol intervention group was given daily intraperitoneal injection(30 mg/kg，once a day).Retinal tissue in each group was gentlely removed after rats were treated for 7 days and tested by HE staining.The levels of superoxide dismutase(SOD)and Glutathione peroxidase(GSH-PX)in retina were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The expression of hypoxia inducible factor(HIF)was evaluated by RT-PCR.Result Compared with control group，the obvious pathological changes were shown in retina of hypobaric hypoxia model group；the level of GSH-PX(P<0.05)and SOD(P>0.05)decreased，whereas，the HIF mRNA expression was upregulated(P<0.01)in this group.In Resveratrol intervention group(P>0.05)，the GSH-PX level，SOD activity and HIF mRNA expression in Resveratrol intervention group were decreased，but there were no statistical difference(P>0.05)in comparison with normal control group.Compared with hypobaric hypoxia model group，the activity of GSH-PX was increased(P<0.05)in Resveratrol intervention，and the increased SOD level also presented in this group，but there was no significant difference(P>0.05)；the HIF mRNA expression was decreased in Resveratrol intervention group compared with hypobaric hypoxia group，significant differences was observed between the two groups(P<0.01).Conclusion Acute hypobaric hypoxia may cause the pathological changes of rat retina.The intervention of resveratrol shows a protective role on acute hypobaric hypoxia induced retina impairment by increasing antioxidant production including SOD and GSH-PX.Meanwhile it can also enhance the ability to remove the free radicals and regulating the expression of HIF.

Acute hypoxia Rats Retinal Injury Resveratrol Protect Mechanism

青海省自然科學基金項目(編號：2014-Z-911)

R774.1

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.04.001

2016-07-09

黨鴻(1990 ～)，女，漢族，青海籍，在讀碩士研究生.※：通訊作者，主任醫師，E-mail：xrgc19@hotmail.com