IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纖維瘤中的表達及其意義

吳賢敏 武鵬 葉凡 李志春 楊開顏 林昶 陳曉云▲

1.溫州醫科大學附屬第一醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，浙江溫州325000；2.福建醫科大學附屬第一醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，福建福州350004；3.溫州醫科大學附屬第一醫院病理科，浙江溫州325000

IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纖維瘤中的表達及其意義

吳賢敏1武鵬1葉凡1李志春2楊開顏3林昶2陳曉云1▲

1.溫州醫科大學附屬第一醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，浙江溫州325000；2.福建醫科大學附屬第一醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，福建福州350004；3.溫州醫科大學附屬第一醫院病理科，浙江溫州325000

目的檢測干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和白細胞介素-1（interleukin 1，IL-1）在鼻咽血管纖維瘤中的表達水平，探討IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纖維瘤骨質破壞機制中的作用。方法應用免疫組化SP法檢測IFN-γ和IL-1在2000～2012年期間20例鼻咽血管纖維瘤和2015年3～6月期間10例正常下鼻甲組織中的表達。結果IFN-γ和IL-1蛋白在JNA中的陽性表達率均為100%，明顯高于IFN-γ和IL-1蛋白在下鼻甲組織中的陽性表達率20%（P均＜0.05）。IFN-γ和IL-1蛋白的表達與JNA臨床分期無關（P＞0.05）。結論IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纖維瘤組織中陽性表達率較高，可能是參與鼻咽血管纖維瘤骨質破壞的相關因素。

干擾素-γ；白細胞介素-1；鼻咽血管纖維瘤；免疫組化

鼻咽血管纖維瘤（juvenile nasopharyngeal angiofibroma，JNA）為鼻咽部最常見的良性腫瘤，常發生于10～25歲的青年男性，由大量的血管、彈性纖維及致密結締組織組成，Liang等［1］認為其本質是血管錯構瘤。雖然JNA是良性腫瘤，但其破壞顱底及周圍骨質可導致嚴重的并發癥。JNA破壞顱底骨質進行擴張性生長的機制尚未清楚。最近在研究病理性骨質破壞性疾病中發現IFN-γ和IL-1在膽脂瘤型中耳炎骨質破壞中發揮重要作用［2-4］。JNA的骨質破壞過程與膽脂瘤的骨質破壞過程有許多相似之處，它們都是良性腫瘤，都會破壞顱底骨質進行擴張性生長。本實驗擬應用免疫組化染色SP法檢測IFN-γ和IL-1在JNA組織中的表達，探討其在JNA骨質破壞機制中的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

20例鼻咽血管纖維瘤標本來自于2000～2012年福建醫科大學附屬第一醫院病理科，福建省耳鼻喉研究所石蠟包埋存檔蠟塊。鼻咽血管纖維瘤組：鼻咽血管纖維瘤患者標本共20例，術后病理診斷均為鼻咽血管纖維瘤，患者年齡11～35歲，平均18.5歲，其中男20例，女0例。按Metin等［5］的腫瘤分期標準：Ⅰ期7例，Ⅱ期6例，Ⅲ期6例，Ⅳ期1例。對照組10例下鼻甲組織術后診斷為下鼻甲慢性炎癥，患者年齡18～40歲，平均25歲，其中男5例，女5例。標本來自2015年3～6月溫州醫科大學附屬第一醫院耳鼻喉-頭頸外科，在內窺鏡下取鼻中隔偏曲伴下鼻甲肥大患者的下鼻甲組織。標本均是24 h內取材，應用4%甲醛固定，常規石蠟包埋，4μm厚連續切片。

1.2 試劑

兔抗人IFN-γ單克隆抗體購自SANTA CRUZ公司和兔抗人IL-1多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學染色

操作嚴格按照說明書進行，步驟如下：①烤片，68℃，20min；②常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-100%酒精Ⅰ10 min-100%酒精Ⅱ10min-95%酒精5 min-80%酒精5 min-70%酒精5 min；③阻斷滅活內源性過氧化物酶：3% H2O237℃孵育10min，PBS沖洗3×5min；④抗原修復：置0.01M枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中煮沸（95℃，15～20min），自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3×5 min；⑤正常羊血清工作液封閉，37℃10 min，傾去勿洗；⑥滴加一抗4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3×5min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照）；滴加生物素標記二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3×5min；⑦滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS沖洗3×5min；⑧DAB/H2O2反應染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復染，常規脫水，透明，干燥，封片。用PBS代替第一抗體作為陰性對照，用已知陽性片做陽性對照。

1.4 免疫組化結果判斷［6］

IFN-γ和IL-1的陽性染色者細胞胞漿有棕黃色顆粒沉著，陽性細胞數：0分為無陽性細胞，1分為陽性細胞數＜25%，2分為陽性細胞數占25%～50%，3分為陽性細胞數占51%～75%，4分為陽性細胞數占＞75%。染色強度：0分為無染色，1分為弱染色，2分為中等強度染色，3分為強染色。計算各抗體的陽性細胞數和染色強度得分，以3～7分為陽性。

1.5 統計學分析

應用SPSS13.0統計學軟件進行分析，IFN-γ和IL-1陽性表達率采用χ2檢驗或者精確概率法進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IFN-γ和IL-1的陽性表達

主要位于JNA血管壁內皮細胞和基質成纖維細胞的胞漿中，呈棕黃色。IFN-γ和IL-1在下鼻甲組織中弱表達或無表達，弱表達顆粒主要位于成纖維細胞胞漿、血管內皮細胞的胞漿和漿液性腺體中，著色強度不一，見封三圖1。分別對JNA組和下鼻甲組的IFN-γ和IL-1陽性表達率分別進行比較，見表1～2。JNA組中的IFN-γ的陽性表達率為100%（20/20），下鼻甲組中的IFN-γ陽性表達率為20%（2/10），JNA組中的IFN-γ表達水平明顯高于下鼻甲組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。JNA組中的IL-1的陽性表達率為100%（20/20），下鼻甲組中IL-1的陽性表達率為20%（2/10），JNA組中的IL-1表達水平明顯高于下鼻甲組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。

表1 IFN-γ蛋白在JNA組織和下鼻甲組織中的表達情況

表2 IL-1蛋白在JNA組織和下鼻甲組織中的表達情況

2.2 IFN-γ和IL-1蛋白在鼻咽血管纖維瘤的不同臨床分期中的陽性表達率

本研究表明IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纖維瘤的不同臨床分期中的表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3、4。

表3 IFN-γ在JNA的不同臨床分期中的表達情況

表4 IL-1在JNA的不同臨床分期中的表達情況

3 討論

IFN-γ對于破骨細胞的調控有不同的觀點，有研究顯示［7］IFN-γ通過快速降解RANK的銜接蛋白-TRAF6來干擾細胞內RANKL信號的傳導，抑制破骨細胞的形成。然而Gao等［8］報道IFN-γ會刺激破骨細胞形成，使MHC-Ⅱ抗原的表達上調，進一步刺激T細胞的活化，活化的T細胞可以產生大量的TNF-α和RANKL，這兩項研究認為IFN-γ這種間接作用已經超過其對破骨細胞前體的抑制作用，進一步導致破骨細胞的形成，造成骨質破壞。Kohara H等［9］研究發現IFN-γ直接抑制破骨細胞生成和誘導細胞凋亡Fas/FasL信號提供，導致骨吸收的間接調控，這是在炎癥部位對骨破壞的保護作用。金玲爽等［10］報道在膽脂瘤中耳炎患者外周血中檢測IFN-γ，顯示IFN-γ促進慢性中耳炎骨質破壞，其結果與馬志超等［11］研究結果相似。IL-1（interleukin-1，IL-1）是一種單核因子，最主要由活化的單核-巨噬細胞產生，成纖維細胞和朗罕氏細胞也可合成和分泌IL-1。IL-1的生物學活性比較廣泛，可作用于機體的各個系統。IL-1可刺激骨細胞產生前列腺素E2（PGE2），然后PGE2再刺激破骨細胞，促進骨質的破壞吸收［12］。Zhang H等［13］研究發現IL-1受體拮抗劑阻斷肌源性干細胞分化為破骨細胞和骨吸收，而且IL-1α可進一步增強破骨細胞分化和骨吸收。Hienz SA等［14］研究發現腫瘤壞死因子-α、IL-1β、PGE2促進破骨細胞的活性，特別是在出現炎癥時如發現牙周炎狀態。有研究顯示白細胞介素-1β是重要的促炎性細胞因子，其參與了RA的發病機制，主要引起關節炎癥和關節軟骨破壞［15-18］。RuscittiP等［19］研究證明白細胞介素（IL）1β是最強大的促炎細胞因子之一，是一種強刺激因素，在體外和體內通過刺激破骨細胞RANKL上調，促進骨吸收。已有研究報道，IL-1存在于膽脂瘤上皮、基質，明顯表達于鄰近膽脂瘤的單核細胞、骨細胞、角化的上皮細胞，于正常的外耳道皮膚也有表達，但在正常皮膚的表達明顯低于膽脂瘤上皮［20］。雖然有研究證明無論有無膽脂瘤，IL-1均可導致慢性中耳炎骨質吸收。但也有研究顯示，當膽脂瘤存在時，骨破壞的范圍更大，程度更嚴重［3］。本研究結果顯示，IFN-γ和IL-1蛋白在JNA中的陽性表達率均為100%，明顯高于IFN-γ和IL-1蛋白在下鼻甲組織中的陽性表達率20%，兩者間有明顯的統計學差異。但是本研究中IFN-γ和IL-1在鼻咽血管纖維瘤的不同臨床分期中的表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05），表明IFN-γ和IL-1蛋白與鼻咽血管纖維瘤的擴張性生長無顯著相關。我們推測IL-1刺激成骨細胞產生前列腺素E2、IL-6可刺激破骨細胞前體細胞的分化，而前列腺素E2和IL-6又可刺激骨吸收，導致骨質破壞。IFN-γ可能刺激破骨細胞形成，使MHC-Ⅱ抗原的表達上調，進一步刺激T細胞的活化，活化的T細胞可以產生大量的TNF-α和RANKL，IFN-γ這種促進作用形成破骨細胞，導致骨質破壞。本研究認為IL-1和TNF-γ在JNA骨質破壞中可能參與兩種主要病理過程：①刺激成骨細胞產生前列腺素等炎癥介質；②通過刺激破骨細胞，減少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解，并產生膠原酶和其他中性蛋白酶，釋放骨鈣等，從而導致骨質的破壞。IFN-γ和IL-1雖然與鼻咽血管纖維瘤的擴張性生長無顯著相關，但IFN-γ和IL-1蛋白在JNA組織中有較高的陽性表達率，我們推測其可能是參與JNA骨質破壞的影響因素，其具體機制有待進一步研究。

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Expression and significance of interferon-γand interleukin-1 in juvenile nasopharyngeal angiofibroma

WU Xianmin1WU Peng1YE Fan1LIZhichun2YANG Kaiyan3LIN Chang2CHEN Xiaoyun1
1.Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery，the First Affiliated Hospital ofWenzhou Medical U-niversity，Wenzhou 325000，China；2.Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery，the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350004，China；3.Departmentof Pathology，the First Affiliated HospitalofWenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China

Objective To investigate the expression of interferon-γand interleukin-1 in human juvenile nasopharyngeal angiofibroma tissues.M ethods Twenty juvenile nasopharyngeal angiofibroma samples collected from 2000 to 2012 and ten normal inferior turbinatemueosa specimens collected from March to June 2015 were enrolled in this study，and expressions of IFN-γand IL-1 were determined by immunohistochemistry.Results The positive rate of IFN-γand IL-1 proteins all was 100%in JNA，obviously higher than that in normal inferior turbinatemueosa which the positive rate was20%（P＜0.05）.The expression of IFN-γand IL-1 protein had no relationship with clinic staging of JNA（P＞0.05）. Conclusion This study reveals that the positive rate of IFN-γand IL-1 are markedly increased in the juvenile nasopharyngeal angiofibroma and are closely related to bone resorption induced by juvenile nasopharyngeal angiofibroma.

Interferon-γ；Interleukin-1；Juvenile nasopharyngeal angiofibroma；Immunohistochemistry

R739.63

A

1673-9701（2016）18-0001-03

2016-03-10）

浙江省溫州市公益性科技計劃項目（Y20140596）

▲通訊作者