提高L-纈氨酸發酵生產水平的幾種方法

O 黃 平

（福建省麥丹生物集團有限公司福州研究中心 福建 350008）

提高L-纈氨酸發酵生產水平的幾種方法

O 黃 平

（福建省麥丹生物集團有限公司福州研究中心 福建 350008）

目前,國內L-纈氨酸工業化生產還存在著許多問題，例如：產酸率低、雜酸比例高、易染菌等，這與日本等國的生產水平還有較大差距。本文歸納了國內纈氨酸產業化過程采取的一些方法，對于L-纈氨酸大規模工業化生產具有一定的參考意義。

L-纈氨酸；發酵生產fv

L-纈氨酸是人體必需的一種支鏈氨基酸，具有多種生理功能。它被廣泛應用于食品、醫藥及飼料等行業，例如，纈氨酸可以作為食品的營養強化劑和增香劑；在醫藥工業中用于制造復合氨基酸注射液和用來合成纈沙坦等藥物；在飼料行業中可以作為一種限制性氨基酸添加劑，提高動物的生產品質。

由于其用途廣泛，市場上高純度的L-纈氨酸處于供不應求局面，因此，相關生產企業都在努力提高纈氨酸的生產水平。

一、分子改造

目前，國內多數企業使用的L-纈氨酸生產菌株來源反復誘變，遺傳背景十分不清晰，很難通過進一步誘變來提高纈氨酸的生產水平。

近年來，隨著谷氨酸棒桿菌的全基因組測序及基因功能分析的完成，分子改造已被廣泛用于構建纈氨酸高產菌株，成為提高L-纈氨酸發酵生產水平的有效方法。利用已知的谷氨酸棒桿菌遺傳學信息，采用基因工程技術改造谷氨酸棒桿菌以提高纈氨酸的產量。

一些適用于用于谷氨酸棒桿菌的表達載體已經被構建，這些表達載體一般為大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌的穿梭載體，有的屬于誘導性表達，有屬于組成型表達。由于同一啟動子在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中的活性差別比較大，所以針對谷氨酸棒桿菌中啟動子的研究也已經展開，與此同時，在谷氨酸棒桿菌中進行基困敲除的各種方法也被建立。目前，有學者已經從優化啟動子、抑制雜酸合成、解除反饋抑制、增加抗性等方面構建出一些高產L-纈氨酸的工程菌。

圖1 谷氨酸棒桿菌質粒pGC42

福建省麥丹生物集團有限公司福州研究中心課題組通過分子改造優化了啟動子并在質粒pGC42中增加了卡那霉素抗性，質粒圖譜見圖1，構建了一株L-纈氨酸的工程菌V3，搖瓶產酸由出發菌株的2.3%提高到3.3%，效果十分明顯。

二、培養基優化

優良的菌種也需要最佳的培養基條件相匹配才能發揮其生產性能，在纈氨酸發酵培養基中，玉米漿、酵母膏和生物素(VH)是非常重要的組成成分。

玉米漿成分非常復雜，為微生物生長代謝提供所需的各種氨基酸、有機磷、生長因子、核酸等。若玉米漿用量不足，菌體生長繁殖受到限制，菌體濃度達不到高密度要求，對產酸不利；用量過多，則菌體濃度大，消耗過多的營養物質，雜酸比例增多，影響纈氨酸的積累。本課題組經過大量的試驗發現玉米漿的質量會顯著影響纈氨酸的產量，當玉米漿中的有機磷含量低于2%就會顯著影響纈氨酸的產量，一般來說有機磷含量在3%以上的玉米漿質量較為理想。

酵母浸膏富含完全蛋白質，多種氨基酸以及B族維生素、核苷酸、微量元素等，是最為理想的生物培養基原料和發酵工業中的主要原料，可以大大提高菌種的生產速率及發酵產品得率。在纈氨酸種子培養基及發酵培養基中添加適量的酵母膏可以促進菌體生長，但酵母膏過量則會導致菌體密度過大，影響纈氨酸積累。

生物素的濃度會影響細胞壁的合成，進而影響細胞內物質的分泌。當生物素用量過少時，細胞壁合成不足，不利于菌體的生長；用量過多則使細胞壁合成過量，添加影響氨基酸分泌到胞外。

此外，有研究表明，在培養基中添加檸檬酸鈉能顯著降低枯草芽胞桿菌代謝途徑中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活力，檸檬酸和葡萄糖的聯合代謝還會減弱糖酵解途徑，從而抑制有機雜酸的生成。本課題組在此研究結果的基礎上，在谷氨酸棒桿菌的發酵培養基中添加一定量的檸檬酸鈉，配方見表1，在30L罐試驗結果發現L-纈氨酸的產量可以由原來的6.7%提高到8.2%，雜酸比例由原來的28%降低到15%，效果非常明顯。

表1 纈氨酸發酵配方

三、搖瓶菌種篩選

搖瓶培養技術問世于二十世紀30年代，由于其簡便、實用，很快便被發展成為微生物培養中極重要的技術而普及，并廣泛用于工業微生物菌種篩選、實驗室大規模發酵試驗、種子培養等，也常用于生產工藝的改良和工藝參數的優化。

由于生產菌種是先經過甘油管保藏后再提供大生產使用，在保藏過程中很有可能出現退化的情況，因此需要重新挑取一定數量單菌落進行篩選，以篩選出生長情況最穩定、產酸水平最高的菌種提供給大生產。

搖瓶篩選的培養基應與大罐發酵培養基保持一致，培養條件也應盡量與大生產相匹配。搖瓶培養結束后通過鏡檢各搖瓶菌種的生長情況、測定各搖瓶培養基pH值和產酸情況以確定最佳菌種保證提供給大生產。

四、30L小罐菌種驗證

菌種的小罐驗證也是氨基酸放大生產過程中一個非常重要的環節。提供大生產的菌種雖然經過搖瓶篩選，但依然有可能會出現“水土不服”的情況,表現為菌體生長緩慢，產酸減少甚至直接導致倒罐等嚴重情況。

原因是搖瓶篩選的條件和大罐生產的條件是兩個不同尺度考量的問題，搖瓶產酸高并不完全意味著在發酵罐上會表現良好。

通過30L小罐驗證，淘汰產酸不穩定的菌種就可以大大降低此類事情發生的概率，菌種驗證是本課題組保障大生產菌種安全穩定的一個重要工作環節。

五、展望

目前，國內生物技術的發展也促使發酵行業的飛速發展，使得L-纈氨酸的生產工藝由以前的技術含量低、勞動強度大、能耗高、轉化率低發展到現在的技術含量高，自動化程度高、能耗低、轉化率高。隨著國內生物技術的進一步發展，纈氨酸的生產水平會逐步提高，逐步達到日本等發達國家的水平。

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Several methods of improving the fermentation production level of L- valine

Huang Ping
（Fujian research center of Fuzhou Province, province, Mai Dan biological Group Co., Ltd.,Fujian,350008）

At present, domestic L-valine industrial production still exist many problems, for example: acid production rate low, heteropoly acid ratio is high, easy to be infected by bacteria and other, the production level of this with Japan and other countries there is a large gap. This paper sums up the domestic valine industrialization process to adopt some methods, for the large-scale industrial production of L-valine has certain reference significance.

L- valine；fermentation FV

T

A

黃平（1982～），男，福建省麥丹生物集團有限公司福州研究中心，研究方向：生物化工、發酵工程。