響應面法優化當歸總黃酮提取工藝研究

蔡璇（肇慶出入境檢驗檢疫局，廣東肇慶526060）

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響應面法優化當歸總黃酮提取工藝研究

蔡璇
（肇慶出入境檢驗檢疫局，廣東肇慶526060）

摘要：以乙醇-水為提取劑，總黃酮提取量為考察指標，通過醇提取法提取當歸中的總黃酮成分。通過單因素試驗分別考察乙醇體積分數、料液比、提取時間、提取溫度對總黃酮提取量的影響，在此基礎上利用Design-Expert軟件Box-Behnken中心組合設計法設計響應面分析料液比、乙醇體積分數、提取時間和提取溫度4個因素對總黃酮提取量的影響，并通過方差分析回歸建立數學模型。料液比1∶11（g/mL），乙醇體積分數70 %，提取時間2.5 h，提取溫度60℃，在此條件下，總黃酮提取量達到0.0228mg/g。結果表明：Box-Behnken設計結合響應面分析法可以很好地對當歸總黃酮提取工藝進行優化。

關鍵詞：當歸；黃酮；提取；響應面法

當歸是傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，其化學成分主要有黃酮類、苯酚類、香豆素類、有機酸類、氨基酸類及多糖類等。當歸的一類重要活性物質就是黃酮類化合物，具有抑制NO生成、抗氧化和抑菌殺菌等作用[1-3]。

本文根據醇提取法，采用單因素試驗分別考察乙醇體積分數、料液比、提取時間、提取溫度對總黃酮提取量的影響，對當歸中總黃酮的提取與含量測定進行初步研究，同時選擇響應面法優化其最適提取方法的工藝條件，旨為進一步開發和利用當歸總黃酮提供理論參考。

1　材料與儀器

1.1材料

當歸（甘肅產）：購于肇慶大參林藥店，粉碎后備用。

1.2儀器與試劑

UV/VIS 916型分光光度計：澳大利亞GBC；FY135中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；SB25-120超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-S2系列恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市環宇科學儀器廠；DHG-907013數顯電熱恒溫干燥箱：上海浦東榮豐科學儀器有限公司；RE-5299旋轉蒸發器：鞏義市予華儀器有限責任公司。

蘆丁對照品：中國藥品生物制品檢定所提供，批號：100080-200707；其它試劑均為分析純；試驗用水為雙蒸水。

1.3方法

1.3.1當歸中類黃酮物質的提取與樣品溶液的制備

準確稱取當歸2 g置于100 mL圓底燒瓶中，以一定的料液比加入乙醇-水溶液進行回流提取，共進行3次提取后，合并3次提取液，過濾后收集濾液為樣品溶液。

1.3.2標準曲線的繪制

精密稱取蘆丁標準品10.00 mg置于50 mL量瓶中，加60 %乙醇水溶液溶解，定容即得。

精密移取上述標準品溶液0.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6 mL分別置于10 mL容量瓶中，各加入60%乙醇溶液至5mL，加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6 min，加入10 %硝酸鋁溶液0.3 mL，再放置6 min，加入1.0 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL，加蒸餾水定容至刻度。于分光光度計上在λ= 508.73 nm處測定其吸光度。以吸光度A為縱坐標，黃酮含量ρ為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.3當歸總黃酮含量的測定

準確吸取樣品溶液適量，按照蘆丁標準曲線制作方法測定吸光度，根據回歸方程計算質量濃度（C），再根據質量濃度計算出當歸中黃酮的提取量[8]。

當歸總黃酮提取量/（mg/g）=樣品中總黃酮含量（mg）×乙醇體積（mL）/樣液體積（mL）×稱取藥材粉末質量（g）

1.3.4當歸總黃酮提取條件的優化方法

選取料液比、乙醇體積分數、提取時間、溫度4個可能影響提取效果的因素做單因素試驗，以確定相關因素對當歸提取物中總黃酮含量的影響，為響應面試驗提供各因素的取值范圍，利用響應面的試驗結果確定當歸總黃酮的最佳提取條件。

1.3.5當歸總黃酮提取響應面法優化分析

本試驗采用Design-Expert 7軟件中的Box-Behnken設計原理設計響應面試驗。根據單因素試驗結果，選取料液比、乙醇體積分數、提取時間和提取溫度4個因素作為試驗因素，以黃酮提取量為響應值設計試驗。試驗因素及水平見表1。

2　結果與討論

2.1標準曲線的制作及回歸方程

以蘆丁標準溶液的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線，見圖1。

表1當歸Box-Behnken的中心組合因素水平表Table 1 The level of the central composition of Angelica sinensis Box-Behnken

圖1蘆丁標準曲線Fig.1 Rutin standard curve

并進行線性回歸，得回歸方程A=11.994ρ+0.029 8，其中A為吸光度，ρ為蘆丁溶液濃度；r2=0.999 9，結果顯示，蘆丁在0.024 g/L～0.052 g/L內具有良好的線性關系。

2.2單因素試驗結果

2.2.1料液比對總黃酮提取量的影響

料液比對總黃酮提取量的影響見圖2。

圖2料液比對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of material liquid ratio on total flavonoids extraction

從圖2可知，在一定范圍內，藥材的黃酮提取量隨料液比的增大而呈上升趨勢，但料液比增大到一定程度后，黃酮提取量逐漸趨于飽和。當歸在料液比為1∶13（g/mL）時總黃酮提取量達到最大，故料液比選擇1∶11、1∶13、1∶15（g/mL）進行響應面法優化。

2.2.2乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響

乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響見圖3。

圖3乙醇體積分數對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on total flavonoids extraction

由圖3可知，藥材的總黃酮提取量隨著乙醇體積分數的增大而逐漸增大，當達到一定峰值時，黃酮的提取量反而下降。這種現象可能是由于脂溶性雜質增多，與黃酮類化合物競爭和乙醇結合，從而導致黃酮類化合物提取率下降。當乙醇體積分數為60 %時總黃酮提取量達到峰值，故選擇50 %、60 %和70 %進行響應面法優化。

2.2.3提取時間對總黃酮提取量的影響

提取時間對總黃酮提取量的影響見圖4。

圖4提取時間對總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time fraction on total flavonoids extraction

由圖4可以看出，藥材的黃酮提取量在一定范圍內，隨提取時間的延長而有所增大，但當延長到一定時間后黃酮的提取量反而下降，可能是由于提取時間過長，黃酮物質被破壞，導致提取量下降。從圖可知，提取時間為2 h時，總黃酮提取量達到最大，故選擇1.5、2 h和2.5 h進行響應面法優化。

2.2.4提取溫度對總黃酮提取量的影響

提取溫度對總黃酮提取量的影響見圖5。

圖5提取溫度對總黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of temperature on total flavonoids extraction

由圖5可以看出，藥材的黃酮提取量隨溫度的提高而有所上升，但當溫度到達一定時，黃酮的提取量會有所下降，可能是溫度過高，黃酮物質的穩定性受到一定影響，且雜質的溶出量也會增加，導致提取量下降。當提取溫度為50℃時，總黃酮提取量達到最大，故選擇40、50℃和60℃進行響應面法優化。

2.3當歸總黃酮水浴法提取條件的優化

2.3.1數學模型的建立

本試驗Box-Behnken中心組合設計的試驗方案和結果見表2，其中1～24為析因試驗，24～29為中心試驗。

表2當歸Box-Behnken中心組合設計方案及結果Table 2 The central composite design scheme and results of Angelica sinensis Box-Behnken

采用響應面分析法分析試驗結果，得以總黃酮提取量為響應值的回歸方程為：

y/（mg/g）=0.016-7.908×10-4A+8.484×10-4B+4.267× 10-4C+1.732×10-3D-1.087×10-3AB-4.72×10-4AC+6.495× 10-4AD-1.223×10-3BC+4.139×10-4BD+2.651×10-3CD+ 2.297×10-4A2-3.321×10-4B2+1.921×10-3C2-7.648×10-4D2

式中：y為總黃酮提取量，A為料液比，B為乙醇體積分數，C為提取時間，D為提取溫度。

2.3.2單因素試驗結果數學模擬

運用軟件對表2中的29個響應值進行回歸分析，得到方差分析表，見表3。

表3當歸黃酮提取回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the extraction of the flavonoids from Angelica sinensis

從表3可知，以總黃酮提取量為響應值時，模型P 為0.479 2>0.05，表明該二次方程模型不顯著，失擬項F值為0.006 0<0.01，回歸模型不能較好的描述各因素與響應值之間的真實關系。各因素及其交互因素、二次項的P值均大于0.05，表明4個提取因素在進行總黃酮提取量優選時沒有優選到最佳條件，需進一步進行優化。

2.3.3響應面法優化當歸總黃酮水浴法提取條件

采用Design-Expert 7軟件分析當歸提取總黃酮中各因素兩兩交互作用對總黃酮提取率影響繪制響應曲面圖，見圖6，得到從當歸中提取總黃酮的最佳工藝條件為料液比1∶11（g/mL），乙醇體積分數70 %，提取時間2.5 h，提取溫度60℃。

圖6當歸各因素兩兩交互作用對總黃酮提取率影響的響應面圖Fig.6 Response surface map of the effect of the interaction between the two two elements and the extraction rate of total flavonoids

2.4驗證試驗

在響應面優化后的最佳條件下，即當歸在料液比1∶11（g/mL），乙醇體積分數70 %，提取時間2.5 h，提取溫度60℃條件下，進行3次平行試驗，總黃酮平均提取量達到0.021 7 mg/g，RSD為2.21 %，模型對其總黃酮提取量的預測值為0.022 8 mg/g，真實值與預測值的誤差為-4.94 %。

4　結論

通過單因素試驗分別考察料液比、乙醇體積分數、提取時間、提取溫度對當歸總黃酮提取量的影響，在此基礎上，采用Design-Expert軟件的Box-Behnken中心組合設計方法設計響應面試驗，建立數學模型，得到了較優的提取工藝條件，并結合響應面分析得到的數學模型，預測更優的工藝條件，在進行驗證試驗后，得到總黃酮最佳提取工藝條件。

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Optimization of Extraction Process of Total Flavonoids from Angelica Sinensis by Response Surface Method

CAI Xuan
（Zhaoqing Entry-exit Inspection and Quarantine，Zhaoqing 526060，Guangdong，China）

Abstract：Using ethanol- water as extracting agent，total flavonoids extraction amount as the indexes，through the ethanol extraction method to extract from Angelica sinensis total flavonoids. The effects of ethanol volume fraction，ratio of material to liquid，extraction time and extraction temperature were investigated by single factor experiment. The Design-Expert software Box-Behnken center combination design method was used to design response surface analysis. The statistical analysis and mathematical modeling were also applied for analysis the data. The results showed that the optimal extraction parameters would be the material liquid ratio of 1∶11（g/mL），ethanol volume fraction of 70 %，extraction time of 2.5 h，and extraction temperature of 60℃. Under these conditions，totalflavonoidsextractionamount reached 0.022 8 mg/g. Box-Behnken design combined with response surfaceanalysismethod can be used to optimize the extraction processof total flavonoidsfrom Angelica sinensis.

Key words：Angelica sinensis；flavonoids；extraction；response surface method

作者簡介：蔡璇（1979—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：商品理化分析。

基金項目：廣東省肇慶市科技創新計劃項目（2014G110）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.026