不同電子供體對厭氧系統生物脫氮效率及微生物群落分布狀態的影響

朱春祎, 黃雪彬, 郭翠香, 閻　寧, 張永明

(上海師范大學 生命與環境科學學院,上海 200234)

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不同電子供體對厭氧系統生物脫氮效率及微生物群落分布狀態的影響

朱春祎, 黃雪彬, 郭翠香, 閻寧, 張永明

(上海師范大學 生命與環境科學學院,上海 200234)

摘要:在厭氧條件下,分別以葡萄糖、甲醇和鄰苯二甲酸氫鉀作為電子供體對NO3--N進行厭氧反硝化實驗,每種電子供體設定兩個C/N比,分別為4 ∶1和10 ∶1.實驗結果表明:在2種C/N比情況下,葡萄糖與甲醇作為電子供體時,總氮的去除速率一致,且都比鄰苯二甲酸氫鉀作為電子供體時要快.當C/N=4時,總氮的去除速率要快71%,而當C/N=10時,總氮的去除速率的差距只有7%.不同有機物作為反硝化的電子供體時,活性污泥樣本中的微生物菌落檢出情況表現出3個反應體系中具有各自優勢的厭氧菌群、硝化及反硝化菌群明顯特征.該微生物群落的分布特點反映出不同有機物作為電子供體時反應系統狀態的差異性.

關鍵詞:電子供體; 反硝化; 生物脫氮; 微生物群落

0前言

化肥制造、燃料生產、肉類加工等工業排放的廢水中一般均含有高濃度的氨氮、硝酸鹽或亞硝酸鹽,通常采用A/O或A2/O等工藝來對這類廢水進行總氮的去除[1-2].采用A/O或A2/O工藝時,氨氮需要通過硝化、反硝化兩階段進行總氮的去除,這一過程需要消耗大量的溶解氧和碳源.因此,為了在脫氮過程中降低溶解氧的消耗和解決反硝化過程中碳源不足的問題,人們探索出同步硝化反硝化[3-4]、短程硝化反硝化[5-6]、厭氧氨氧化[7]等工藝方法,避免全程硝化反應以節省動力消耗,尤其是減少有機碳源的消耗,而提高污水中本身含有的碳源在反硝化過程中的利用是最為經濟的方式.因此,提高有機碳源(電子供體)的利用效率已成為當今廢水脫氮技術亟待解決的問題之一.很早就有研究發現,厭氧反應系統在一定條件下可以達到硝酸鹽的良好去除[8-9],當有適當碳源提供時,硝酸鹽的反硝化脫氮反應可以順利進行,實驗數據顯示在厭氧反應器中,當硝酸鹽進水濃度為20~410 mg/L時脫氮效率可以達到89%~98%,有的情況下甚至可以達到硝酸鹽的徹底去除.

在通常的生物脫氮過程中,除了提供一定的有機碳源作為電子供體之外,還需確保反應體系有一定的厭氧條件,即確保其溶解氧在一定的濃度之下.通常在厭氧體系中,往往會伴隨著甲烷的產生.有人在研究UASB和MBR組成的硝化反硝化系統時,在UASB反應中觀測到明顯的,有機碳源被反硝化過程利用,從而降低了甲烷產量[5].進一步有研究證實,在厭氧反應體系中常常伴隨著導致甲烷氧化的現象,即厭氧過程中產生的甲烷在硝酸鹽氮存在的條件下可被氧化,并導致脫氮現象[10].從廢水脫氮角度考慮,厭氧環境中甲烷氧化作為反硝化的電子供體,可在很大程度上解決碳源不足的問題.

通常生物反應體系可以通過適當的操作或控制實現所設定的缺氧條件,而選擇何種碳源就成為反硝化脫氮的關鍵因素.本研究分別以甲醇、葡萄糖和鄰苯二甲酸氫鉀作為有機碳源,加入到硝酸鹽為營養物質厭氧反應器中,在不同碳氮比的條件下建立厭氧反硝化體系,并在測定其反硝化反應效率的基礎上,對微生物體系中微生物群落分布進行系統分析.同時借助分析反應系統中微生物群落組成的規律,判斷反硝化系統中微生物對有機物及營養物質利用的狀態.本研究擬通過反應器運行效果分析結合微生物群落狀態的分析,解析厭氧條件下總氮去除的機理,并有利于在工程應用上采取有效的控制手段保持微生物體系的高效運行.

1材料與方法

1.1溶液制備

實驗用水采用人工配置,在自來水中加入含有碳源、硝酸鹽、磷營養元素及微量元素的配制溶液.實驗溶液配制用水為Milli-Q Integral水純化系統制備的純水.微量元素混合溶液組成(g/L)為:FeCl2·4H2O 1.5,NiCl2·6H2O 0.024,CoCl2·6H2O 0.19,CuCl2·2H2O 0.002,MnSO4·7H2O 0.1,Na2MoO4·2H2O 0.024,ZnCl20.07,H3BO30.006.試驗用葡萄糖、鄰苯二甲酸氫鉀、甲醇、硝酸鈉、磷酸二氫鉀和碳酸氫鈉等藥劑均為分析純,購自上海國藥集團.

1.2活性污泥馴化

活性污泥來源為上海龍華水質凈化廠的二沉池污泥.在500 mL的搖瓶里采用葡萄糖為碳源進行培養和馴化,當污泥沉降性能達到SV30,上清液清澈,且對COD的降解效率穩定在70%以上后,將此活性污泥定量加入3個250 mL的錐形瓶里,分別采用葡萄糖、甲醇和鄰苯二甲酸氫鉀進行反硝化污泥的馴化.控制COD從400 mg/L 逐漸增加至1000 mg/L,NO3--N從20 mg/L逐步增加到100 mg/L.實驗過程中C/N比為4和10,N/P比始終保持在5 ∶1.反應過程中搖瓶采用充氮氣方式排除液體上方氧氣并封口,將錐形瓶里的溶解氧控制在0.5~1.0 mg/L以下.反應中采用磁力攪拌器進行攪拌,保持污泥和溶液的良好混合狀態,采用續批式運行,反應換水周期為24 h.當60 mg/L的NO3--N在12 h的反應時間內達到80%以上的去除率時,認為生物反硝化馴化完成.

1.3反應裝置運行

分別用葡萄糖、甲醇和鄰苯二甲酸氫鉀作為碳源,將馴化好的污泥分別放置在3個250 mL的錐形瓶內,并加入微量元素等其他所需營養元素進行反硝化實驗.硝酸鹽的生物降解實驗中的3種碳源分別采用的C/N比為4和10.當NO3--N的初始濃度為60 mg/L時,分別以C6H12O6、CH3OH和C8H5KO4為碳源進行序批式反應,反應時間根據需要設定.實驗中定時間取樣,水樣均經過0.22 m的水系膜過濾后進行測試分析.

反硝化動力學實驗以C6H12O6、CH3OH和C8H5KO4為碳源,設置不同NO3--N初始濃度在30~210 mg/L之間進行反硝化實驗,測試NO3--N在反應最初10 min內的濃度變化進行動力學研究.實驗中定時間取樣,水樣經過0.22 m的水系膜過濾后進行測試分析.

1.4分析方法

NO3-用DIONEX ICS-5000離子色譜進行分析,所得結果再轉化為NO3--N.COD參照《水和廢水監測分析方法》(中國環境科學出版社,2002年,第四版)中重鉻酸鉀法.

在實驗結束時,分別從以葡萄糖、甲醇、鄰苯二甲酸氫鉀為碳源的反應系統中提取穩定的活性污泥樣本,低溫密封保存在離心管中,分別標注為Glc(葡萄糖)樣本,MeOH (甲醇)樣本和KHP(鄰苯二甲酸氫鉀)樣本.在24 h內送至上海捷瑞生物有限公司進行分子生物學分析.使用DNAzol試劑抽提微生物DNA以作為PCR反應的模板,測試分析采用的通用引物為細菌16Sr DNA:F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和R (5′-CAKAAAGGAGGTGATCC-3′).

2結果與討論

2.1有機碳源對總氮去除速率的影響

圖1　以葡萄糖、甲醇和鄰苯二甲酸氫鉀為電子供體時總氮的去除情況(其中(E)為實驗值,(C)為計算擬合值)

C/Nα電子供體kPearson'sR24∶10.33葡萄糖0.960.967甲醇0.960.941鄰苯二甲酸氫鉀0.560.96310∶10.83葡萄糖0.620.995甲醇0.620.992鄰苯二甲酸氫鉀0.580.992

k單位:α=0.33時為(mg·L-1)0.87·h-1,α=0.83時為(mg·L-1)0.17·h-1

當C/N比為4時,無論以哪種有機物作為電子供體,其反硝化速率都較低.此時的反應級數為α=0.33,以葡萄糖和甲醇為電子供體時,其TN去除速率常數均為0.96 (mg·L-1)0.87·h-1,而以鄰苯二甲酸氫鉀為電子供體時,其常數為:0.56 (mg·L-1)0.87·h-1.即以葡萄糖和甲醇為碳源時,TN去除速率比以鄰苯二甲酸氫鉀時高出71%.

當C/N=10時,總氮去除速率明顯提高,此時的反應級數提高到了0.83,以葡萄糖和甲醇為電子供體時,其TN去除速率常數均為0.62 (mg·L-1)0.87·h-1,以鄰苯二甲酸氫鉀為電子供體時,其常數為:0.58 (mg·L-1)0.87·h-1.此時,不同有機物作為電子供體時,他們對TN去除速率的效率較為接近.這一實驗結果表明,當有機碳源充足時,有機物種類的影響不是主要的.而當C/N較小時,有機物種類對TN的去除速率影響較大.

當反應器HRT為12 h時,以葡萄糖、甲醇和鄰苯二甲酸氫鉀為電子供體的總氮及硝酸鹽氮去除情況如圖2所示.C/N=10時,葡萄糖、甲醇和鄰苯二甲酸氫鉀的總氮及硝酸鹽氮去除率分別為95.2%、95.4%、99.7%和95.4%、100%、100%;當反應器HRT為12 h、C/N=4時,葡萄糖、甲醇和鄰苯二甲酸氫鉀的總氮及硝酸鹽氮去除率分別為47.6%、57.9%、37.4%和66.5%、58.4%、40.2%.可見,C/N=10時不同電子供體的TN和NO3-的去除基本同步;C/N=4時甲醇和鄰苯二甲酸氫鉀則基本同步,但以葡萄糖為底物的反應器中的NO3-的去除率比TN去除率多出18.9%,表明葡萄糖為底物時NO3-雖然降解了,但并未被反硝化脫氮,這18.9%的轉化后的NO3-可能以NO2-或NH4+的形式表現在TN中.因此,雖然從動力學角度看C/N=4時葡萄糖和甲醇的TN去除動力學常數k均為0.96,但從NO3--N反硝化轉化率看,甲醇和鄰苯二甲酸氫鉀作為電子供體時的NO3-和TN的去除基本同步,脫氮效率明顯高于葡萄糖;C/N=10時,可能源于同化作用時需要消耗更多的N源,NO3-和TN的去除在整個反應過程中同步進行,反應結束時去除率介于95%~100%,NO3-和TN同步消耗殆盡.推測由于碳氮比較高,底物氮源同化作用較強,在TN的去除上,不同的電子供體間沒有顯示出明顯差異.

圖2　葡萄糖、甲醇和鄰苯二甲酸氫鉀為電子供體時總氮及硝酸鹽氮的去除

2.2有機碳源微生物群落分布之間的關系

反應器中微生物樣品A、B與C中的細菌基因組DNA抽提后進行PCR擴增,擴增產物經電泳分離純化后克隆到PMD18-T載體上.為了鑒定活性污泥的菌種組成,所有樣品隨機挑選了100個克隆測序.測序結果根據GenBank數據庫進行BLAST比對(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

從表2的3個樣本的測序分析結果可以看出,葡萄糖為碳源的活性污泥克隆樣本中的微生物群落種類較為豐富,統計測序結果得出總共有31個相關菌種;甲醇為碳源的活性污泥克隆樣本中檢出不同菌屬25種;鄰苯二甲酸氫鉀為碳源的活性污泥克隆樣本中檢出了不同菌屬19種.Glc樣本、MeOH樣本、KHP樣本的優勢菌屬占比分別如圖3所示.

在Glc、MeOH及KHP的3個污泥克隆樣本中Anaerolineathermophile菌株的檢出占比分別為10%、4%、8%,為典型的嗜熱厭氧菌屬;3個污泥克隆樣本中菌株RhodopirellulabalticaSH1的檢出占比分別為2%、8%、6%,為浮霉菌門的紅小梨形菌屬,是一種專性厭氧產氫菌[11].Thioalkalivibriosp.K90mix在3個樣本中的檢出比分別為2%、2%、2%,該菌屬為專性化能自養微生物,可產生亞硝酸還原酶,說明3個處于厭氧狀態的反應器中均存在微生物的對NO3-的脫氮行為[12].此外,3個樣本中均含有Paracoccusdenitrificans、Aromatoleumaromaticum、Mesorhizobiumsp.等各類反硝化菌屬[13].表明3個序批式反應器厭氧狀態良好,并且存在微生物的脫氮行為.3個樣本中AlkaliphilusmetalliredigensQYMF的占比分別為5%、8%、3%,表明有機物降解通過堿性無氧呼吸進行[14],而無氧呼吸的特點是以無機氧化物為最終電子受體,如NO3-、SO42-、CO2等,從而也可判斷出系統的反硝化行為.

表2　不同碳源微生物樣品中微生物群落分布

在以MeOH和KHP為電子供體的污泥樣本中,Thauerasp. MZ1T的占比分別達到25%和36%,Glc樣本中僅為2%.Thauerasp. MZ1T已知可以以硝酸鹽為電子受體,并以多種芳香族有機物為電子供體進行反硝化反應,使厭氧反應產生的部分有機物中間產物被反硝化反應利用,降低了有機物在厭氧環境中被轉化為甲烷的總量[15].Glc樣本中雖然Thauerasp. MZ1T不是優勢菌屬,但其CandidatusAccumulibacterphosphatisclade的占比最高,為29%;在MeOH樣本及KHP樣本中,CandidatusAccumulibacterphosphatis的占比也分別達到9%及22%,均為優勢菌株.本實驗配水中始終保持N ∶P為5 ∶1的比例,由于反應器處于良好的厭氧狀態,氮磷的供給均為過量,已知CandidatusAccumulibacterphosphatis是反硝化除磷系統中的典型優勢菌屬,在厭氧條件在體內儲存過量的磷酸鹽,同時以硝酸鹽為電子受體進行反硝化脫氮[16-17].因此,從微生物群落特點也可以判斷出反應器底物中存在充分的氮磷營養,在3個不同有機底物的反應器內均積累了大量的厭氧反硝化除磷微生物.

圖3　不同電子供體污泥樣本中優勢菌屬分布情況

從部分被檢出的菌株的生長代謝特點,也可以分析了解其對反應器中有機物的降解的特點及基本降解途徑.Pedobacterheparinus在MeOH樣本及KHP樣本中的占比均為6%,為優勢菌屬,但在Glc樣本中未檢出,該細菌是最先被分離鑒別的可以利用肝磷酯作為唯一碳源和氮源而生長的鞘脂桿菌科菌屬,可以產生多種裂解酶,包括可以降解黏多糖的酶類[18],有利于有機物及其中間產物的分解.在污泥樣本MeOH中Aromatoleumaromaticum達7%,屬優勢菌株.該菌株是含有短鏈醇脫氫酶的反硝化細菌,可以對各種有機醇類進行脫氫氧化[19],說明甲醇底物降解是通過甲醇脫氫氧化為不飽和烴甲醛的這一途徑進行的.而在Glc、MeOH及KHP樣本中Beijerinckiaindicasubsp.的檢出占比分別為2%、4%、4%,Beijerinckiaindica是典型的甲烷營養型菌屬,甲烷營養型菌屬通常被分為I型和II型.Beijerinckiaindica為II型甲烷氧化菌,僅以甲烷、甲醇為唯一的碳源和能源進行生長,但也有研究發現這一菌屬中存在兼性營養型甲烷氧化菌可以利用乙酸等基質[20].本研究中采用的3個反應器均處于隔絕空氣狀態,系統的微生物菌落結構也證明了反應器的厭氧環境良好,反應系統中的甲烷氧化菌氧化有機物的氧來源僅能依靠配水中的NO3-提供,因此可以判斷甲烷氧化菌Beijerinckiaindica通過利用硝酸鹽中的氧將甲烷進行單加氧反應生成甲醇,再氧化為甲醛;然后甲醛可通過絲氨酸途徑同化,或被氧化為甲酸后再礦化為二氧化碳[21-22].

另外,在反應系統中還檢出一些特殊菌屬,如Glc、MeOH樣本中檢出了Acidimicrobiumferrooxidans菌株,屬于放線菌門酸微菌目的酸微菌屬.嗜酸細菌通常以硫和亞鐵營自養生活,可以以氫作為電子供體生長[23],而A.ferrooxidans可在葡萄糖酵母提取物等底物中混合營養生長[24].在MeOH樣本中占比4%的約氏黃桿菌Flavobacteriumjohnsoniae具有分泌內切酶進行催化水解的能力[25].此外,3個樣本中分別檢測出1%~3%的脫鹵菌屬Dehalococcoidessp.,是含有鹵代有機物的底物中的常見菌屬[26],但其在厭氧脫氮反應系統中的功能有待研究.總體上看,污泥樣本中的微生物菌落檢出情況可以反應出反應器的運行狀況,3個反應器中厭氧菌群、硝化及反硝化菌群特征明顯;Aromatoleumaromaticum、CandidatusAccumulibacterphosphatis等菌屬的存在也反映出底物磷過剩和底物種類的影響;Beijerinckiaindicasubsp.可以看出厭氧過程進行到了產甲烷過程.因此,從微生物群落分布特征可以對反應器運行狀況作出定性的判斷.

從底物電子供體分析,在3個樣本中檢出的相同菌屬共有15種,分別占3個系統中克隆數量的70%、80%、92%,不同電子供體的反應器中微生物群落分布相近.但從優勢菌屬的角度來看,甲醇和鄰苯二甲酸氫鉀為電子供體的污泥樣本相似度較高,MeOH/KHP樣本間存在4種相同的優勢菌屬,重疊率達46%;對比其他樣本僅存在2種相同的優勢菌屬,Glc/MeOH及Glc/KHP樣本間優勢菌屬的重疊率僅為14%及30%.

從反應系統的NO3-脫氮轉化率看,C/N=4時不同電子供體的TN去除率在37.4%~57.9%之間,MeOH和KHP為電子供體時TN和NO3-的去除率同步進行,但Glc為電子供體的反應器NO3-的去除率比TN去除率多出18.9%,硝酸鹽反硝化率較低.不同污泥樣本克隆中檢出的可進行反硝化行為的菌屬包括Paracoccusdenitrificans、Aromatoleumaromaticum、CandidatusAccumulibacterphosphatis、Paracoccusdenitrificans、Thauerasp. MZ1T以及Thioalkalivibriosp.、Mesorhizobiumsp.,在Glc樣本、MeOH樣本和KHP樣本中的占比分別為39%、46%、63%,Glc為電子供體時微生物群落中反硝化菌群的占比相對較低;污泥樣本分析也表明MeOH/KHP樣本間優勢菌屬重疊率高達46%.由此可見微生物群落的分布可以反映出反應器的運行效率和生化反應系統的差異性.

3結論

(1) 從總氮降解速率看,以葡萄糖和甲醇為電子供體,當C/N=4時,TN去除速率常數比以鄰苯二甲酸氫鉀為電子供體時高出71%,可能源于葡萄糖和甲醇的生物易降解性;而鄰苯二甲酸氫鉀不屬于易生物降解碳源,成為TN去除速率的限制因素.當C/N=10時,葡萄糖、甲醇、鄰苯二甲酸氫鉀的TN去除速率常數沒有明顯差異,推測由于碳氮比較高,氮源底物同化作用較強,不同電子供體間未體現出反硝化差異.

(2) 從硝酸鹽氮的脫氮轉化率看,當反應器HRT為12 h時,C/N=10時不同電子供體的TN和NO3-的去除基本同步,可能亦是受到氮源底物同化作用較強的影響.C/N=4時,葡萄糖和甲醇的TN去除動力學常數k均為0.96,但從轉化后的NO3-的脫氮率看,甲醇和鄰苯二甲酸氫鉀作為電子供體時的NO3-和TN的去除率基本相同,脫氮率明顯優于葡萄糖;葡萄糖作為電子供體的反應器中存在約18.9%的轉化后的NO3-未能進行反硝化脫氮.

(3) 污泥樣本中的微生物菌落檢出情況可以反應出反應器的運行狀況,3個反應器中厭氧菌群、硝化及反硝化菌群特征明顯;Aromatoleumaromaticum、CandidatusAccumulibacterphosphatis、Beijerinckiaindicasubsp.等菌屬的存在反映出反應系統的底物磷過剩、厭氧產甲烷過程以及電子供體種類特征等特點.因此,從微生物群落分布特征可以對反應器運行狀況作出定性的判斷.

(4) 從反應系統硝酸鹽氮的脫氮轉化率看,C/N=4時MeOH和KHP為電子供體時TN和NO3-的硝酸鹽反硝化率介于95%~100%,去除率基本同步;而Glc為電子供體的反應器中NO3-的去除率比TN去除率高了18.9%,可見Glc為電子供體的硝酸鹽反硝化率較低.同時,Glc為電子供體時微生物群落中反硝化菌群的占比最低,而MeOH/KHP樣本間優勢菌屬重疊率最高.由此可見,微生物群落的分布可以反映出反應器的運行效率和生化反應系統的差異性.

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(責任編輯：郁慧)

Effects of electron donor on biological nitrogen removal efficiency andmicrobial community distribution of anaerobic biological system

ZHU Chunyi, HUANG Xuebin, GUO Cuixiang,YAN Ning, ZHANG Yongming

(College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)

Abstract:Glucose (Glu),methanol (MeOH) and potassium hydrogen phthalate (KHP) were in dividually used as electron donor for anaerobic denitrification of NO3--N and C/N ratio was respectively set as 4∶1 and 10∶1 electron donor for each.The experimental results show that Glu and MeOH have similar total nitrogen (TN) removal rates had which are higher than that of KHP under C/N ratias of both 4∶1 and 10∶1.The TN removal rates with Glu and MeOH as electron donors are higher by 71% than that with KHP at C/N of 4∶1,but the difference decreases to 7% at C/N of 10∶1.For the different electron donors,microbiological communities gave obvious characteristics in their in activated sludge systems,in which the electron donors corresponded to their in dividual advantage anaerobic,nitrifying and denitrifying bacteria,and reflected system difference.

Key words:electron donor; denitrification; biological nitrogen removal; microbial community

中圖分類號:X 506

文獻標志碼:A

文章編號:1000-5137(2016)01-0094-09

通信作者:閻寧,中國上海市徐匯區桂林路100號,上海師范大學生命與環境科學學院,郵編:200234,E-mail:yn3258@shnu.edu.cn

基金項目:上海師范大學校級項目(SK201232)

收稿日期:2015-05-25