姜黃素對魚藤酮損傷的多巴胺能神經元的保護作用

?

姜黃素對魚藤酮損傷的多巴胺能神經元的保護作用

潘峰△

南陽市中心醫院神經內科 南陽 473000

△男，1985年4月生，碩士，主治醫師，研究方向：癲癇及神經系統變性病變，E-mail：pppfff850423@163.com

關鍵詞姜黃素；魚藤酮；內源性抗氧化酶；多巴胺能神經元

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是最常見的神經系統變性疾病之一。目前PD治療以應用多巴胺的替代品左旋多巴或多巴胺受體激動劑為主，這些藥物雖能有效緩解PD的臨床癥狀，但長期用藥會產生療效減退、癥狀波動、運動及非運動并發癥。原則上PD一旦被診斷就應及早予以保護性治療，其目的是延緩疾病的發展、改善患者的癥狀。氧化應激在PD的進展過程中占有主導地位[1-2]。氧化應激損傷涉及氧化應激和抗氧化系統的失衡，早期給以抗氧化劑可能限制氧化損傷。姜黃素(curcumin,Cur)是從姜黃中提取的酚性色素，為姜黃的主要有效成分,具有抗氧化作用[3]。作者以魚藤酮(rotenone,Ro)損傷大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株PC12細胞為氧化應激損傷模型，觀察Cur對損傷細胞的保護作用，為Cur對PD治療的基礎研究打下基礎。

1材料與方法

1.2細胞模型的建立[4]PC12細胞(中國典型培養物保藏中心，武漢大學)，在含PRIP 1640培養基(含體積分數10%馬血清、體積分數5% FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、雙抗)塑料培養瓶中，37 ℃、體積分數5% CO2條件下培養。對數生長期細胞用含體積分數1% FBS的培養基進行饑餓培養，8 h后用含50 μg/L NGF、體積分數1% FBS的培養基培養，隔天2/3原體積換液。誘導7 d待細胞間長出網狀纖維、形成類交感神經元細胞即為帕金森病細胞模型建立。

1.3MTT檢測細胞活性對數生長期細胞按每孔1×104mL-1的密度種入96孔板內，每孔200 μL。設對照組，Ro組(1 μmol/L)，Ro+0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L Cur組，0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L Cur組，每組設5個復孔。對數生長期細胞誘導7 d，Ro組加入1 μmol/L Ro，Ro+0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L Cur組加入1 μmol/L Ro和對應濃度的Cur，0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L Cur組只加入對應濃度的Cur，對照組只加培養基，培養24 h。每孔加5 g/L MTT溶液20 μL。繼續孵育4 h后終止培養，吸盡孔內上清液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min。酶標儀在波長570 nm處讀取吸光度(A)值。細胞活性=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)。

1.4活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平測定對數生長期細胞按每孔4×104mL-1的密度種入24孔板內，每孔600 μL。設Ro組、Cur組、Ro組+Cur組、(活性氧陽性)對照組，每組設4個復孔。對數生長期細胞誘導7 d，藥物處理24 h后，離心棄上清，按ROS檢測試劑盒說明進行操作后，按200 μL/孔加入96孔板，激發波長488 nm，發射波長535 nm，用熒光酶標儀檢測熒光量，即為ROS水平。

1.5總谷胱甘肽含量測定對數生長期細胞按每孔4×104mL-1的密度種入12孔板內，每孔1.2 mL。設Ro組、Cur組、Ro組+ Cur組、對照組，每組3個復孔。對數生長期細胞誘導7 d，藥物(1 μmol/L的Ro和Cur)處理24 h后，收集細胞，離心盡棄上清。按總谷胱甘肽檢測試劑盒要求操作后，將96板中待測物在酶標儀下用波長412 nm測A值，即為細胞內總谷胱甘肽含量。

1.7統計學處理采用SPSS 16.0分析，各組細胞活性變化的比較采用單因素方差分析，各組細胞內ROS水平、總谷胱甘肽含量以及Nrf2蛋白表達量的比較采用2×2析因設計的方差分析，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1各組PC12細胞活性的變化見表1。

表1　各組PC12細胞活性比較

F=15.877,P<0.001；*：與對照組比較，P<0.05；#：與Ro組比較，P<0.05。

2.2各組PC12細胞內ROS水平見表2。

表2　各組PC12細胞內ROS水平

FRo=35.010,P<0.001；FCur=60.010,P<0.001；FCur×Ro=101.853,P<0.001。

2.3各組PC12細胞內總谷胱甘肽含量見表3。

表3　各組PC12細胞內總谷胱甘肽含量

FRo=35.481,P<0.001；FCur=53.371,P<0.001；FCur×Ro=37.781,P<0.001。

2.4各組PC12細胞胞質與胞核中Nrf2蛋白表達量見圖1、2和表4、5。Ro組、對照組中Nrf2蛋白幾乎全部定位在細胞質中，而Cur處理之后，細胞胞質中Nrf2蛋白量急劇減少，Nrf2幾乎全部定位于胞核。Cur可激活Nrf2，使其從胞質移位于胞核。

1：Cur組；2：Ro組；3：Cur+Ro組；4：對照組。圖1　各組細胞胞質中Nrf2蛋白的表達

1：Cur組；2：Ro組；3：Cur+Ro組；4：對照組。圖2　各組細胞胞核Nrf2蛋白的表達

RoCur+-+0.20±0.020.87±0.04-0.28±0.030.89±0.07

FRo=65.351,P<0.001；FCur=37.278,P<0.001；FCur×Ro=56.832,P<0.001。

表5　各組細胞胞核中Nrf2表達水平的比較

FRo=38.721,P<0.001；FCur=54.321,P<0.001；FCur×Ro=72.241,P<0.001。

3討論

Ro是一種從魚藤膠中分離的化學物質，毒性很大，脂溶性很強，易穿過血腦屏障和細胞膜，穿過細胞膜進入細胞后在亞細胞器內發生聚集。研究[4]表明PC12細胞對Ro的作用較為敏感，10 nmol/L即可引起PC12 細胞凋亡，且隨藥物濃度的增加而增加，并在1 μmol/L Ro作用下出現半數致死[5]。張海娜等[6]用Ro成功地模擬了PD的兩個主要特征：黑質DA 能神經元的變性死亡和胞質內Lewy小體的形成，即細胞凋亡和蛋白聚集，初步建立了Ro作用下PC12細胞損傷的PD細胞模型。在NGF的誘導下，PC12細胞向類似神經元方向分化，在形態、生理、生化及功能等方面接近于中腦的DA能神經元，被廣泛應用于研究PD的細胞模型[7]。

PD是一種常見的神經系統變性疾病，其基本的病理特征為黑質致密部DA能神經元進行性變性、死亡。氧化應激被在PD的進展過程中占有主導地位。氧化應激是細胞氧化-抗氧化失衡而導致的應激損傷狀態，在這種狀態下細胞的抗氧化防御系統不能使ROS維持在非細胞毒性水平，當ROS的生成增加而其清除減少，或者對氧化修飾的大分子修復減少時，氧化應激就會發生[8]。DCFH-DA是一種自身不發熒光的化合物，它能自由透過細胞膜，被胞質內ROS氧化為熒光化合物DCF。DCF能發出很強的熒光，通過檢測DCF的熒光強度，反映細胞內ROS水平。

Nrf2是轉錄因子家族成員，其調控作用通過抗氧化物反應元(antioxidant response elements，ARE)實現[9]。Nguyen等[10]發現Nrf2/ARE系統能夠誘導機體產生抗氧化酶，從而增強了細胞清除ROS的能力，以此來維持細胞內氧化還原狀態的平衡和降低氧化損傷。研究[11-12]結果提示，Nrf2/ARE信號通路對于多種類型細胞(胚胎成纖維細胞、肝細胞等)抵抗氧化應激介導的細胞毒性具有重要意義。Cur被證實在視網膜細胞、肝細胞中能通過激活Nrf2/ARE信號通路、誘導多種的表達，提高細胞內源性抗氧化能力，從而細胞發揮保護作用。Cur對MPP介導的PC12細胞的凋亡提供顯著的細胞保護作用[13]。

在采用6-OHDA建立的PD動物模型中[14]，Cur可抑制黑質酪氨酸羥化酶陽性細胞凋亡，并能維持紋狀體的DA水平。潘靜等[15]指出在建立的MPTP誘導的PD小鼠模型中，Cur可以有效地拮抗MPTP誘導小鼠黑質多巴胺能神經元的丟失，其機制可能與Cur降低黑質多巴胺能神經元活性氧含量以及抑制炎癥反應等作用有關。然而，Cur在上述PD模型中的細胞保護機制是否與Nrf2/ARE信號通路活化有關，并未得到深入的研究。該研究結果顯示:1.0 μmol/L Cur處理后， PC12細胞活性較Ro組增加最多，保護作用最強。作為外源性Nrf2誘導劑，Cur在低濃度范圍內能通過激活Nrf2/ARE信號通路誘導細胞內抗氧化酶，主要是內源性抗氧化酶(還原性谷胱甘肽)的活性，清除細胞內ROS，發揮抗氧化作用，從而使ROS的產生與抗氧化的不平衡狀態改善，從而減輕了Ro誘導的PC12 細胞的損傷，但隨著濃度增加，保護作用降低，甚至起促氧化作用。總谷胱甘肽是腦組織內重要的非蛋白性抗氧化劑及氧化還原調節因子。研究[16]發現，Cur可以提高多巴胺能神經元細胞內的總谷胱甘肽水平，并經silico模型實驗表明，這一效應是由Cur誘導的GCL基因轉錄上調所致。該研究結果表明，經Cur處理過的致損PC12細胞，Nrf2蛋白的表達主要出現在細胞核內，而對照組和Ro組中Nrf2蛋白的表達主要出現在細胞質內。

綜上所述，Cur可能通過激活Nrf2/ARE信號通路發揮較強的抗氧化活性及細胞(包括神經元)保護作用。

參考文獻

[1]中華醫學會神經病學分會帕金森病及運動障礙學組.中國帕金森病治療指南[J].中華神經科雜志,2009,42(3):352

[2]MILLER RL，JAMES-KRACKE M,SUN GY,et al.Oxidative and inflammatory pathways in parkinson′s disease[J].Neurochem Res,2009,34(1):55

[3]M KHOPDE S,PRIYADARSINI KI,VENKATESAN P,et al.Free radical scavenging ability and antioxidant efficiency of curcumin and its substituted analogue[J].Biophys Chem,1999,80(2):85

[4]胡丹,孫圣剛.魚藤酮對大鼠嗜鉻細胞瘤細胞PC12的毒性作用[J].神經損傷與功能重建,2008,3(5):298

[5]王翔宇,楊紅衛,梅元武.姜黃素對多巴胺誘導PC12細胞凋亡的保護作用[J].西安交通大學學報(醫學版),2013,34(1):115

[6]張海娜,胡國華,陳秋惠,等.帕金森病細胞模型的建立及魚藤酮對多巴胺能神經元的毒性作用[J].吉林大學學報(醫學版),2007,33(5):811

[7]WANG G,QI C,FAN GH,et al.PACAP protects neuronal differentiated PC12 cells against the neurotoxicity induced by a mitochondrial complex Ⅰ inhibitor, rotenone[J].FEBS Lett,2005,579(18):4005

[9]CHEN F,SHI XL.Intracellular signal transduction of cells in response to carcinogenic metals[J].Crit Rev Oncol Hematol,2002,42(1):105

[10]NGUYEN T,SHERRATT PJ,PICKETT CB.Regulatory mechanisms controlling gene expression mediated by the antioxidant response element[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,2003,43(2):233

[11]李強,趙曙光,王旭霞,等.姜黃素激活轉錄因子Nrf2對人肝細胞氧化應激的影響[J].胃腸病學和肝病學雜志,2010,19(2):154

[15]潘靜,丁健青,陳生弟.姜黃素對帕金森病小鼠模型黑質多巴胺能神經元損傷的保護作用[J].中國現代神經疾病雜志,2007,7(5):447

[16]JAGATHA B,MYTHRI RB,VALI S,et al.Curcumin treatment alleviates the effects of glutathione depletion in vitro and in vivo: therapeutic implications for Parkinson's disease explained via in silico studies[J].Free Radic Biol Med,2008,44(5):907

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.034