PKH26標記的人臍帶間充質干細胞在大鼠子宮內膜的示蹤

韓　華，趙紅偉，康進生，高海祥(.河北省人民醫院婦一科,河北 石家莊 05005；.河北省人民醫院消化科，河北 石家莊 05005；.河北省人民醫院功能神經外科,河北 石家莊 05005；.河北省人民醫院呼吸科,河北 石家莊 05005)

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·論著·

PKH26標記的人臍帶間充質干細胞在大鼠子宮內膜的示蹤

韓華1，趙紅偉2，康進生3，高海祥4(1.河北省人民醫院婦一科,河北 石家莊 050051；2.河北省人民醫院消化科，河北 石家莊 050051；3.河北省人民醫院功能神經外科,河北 石家莊 050051；4.河北省人民醫院呼吸科,河北 石家莊 050051)

[摘要]目的觀察PKH26標記人臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesencymal stem cells,UC-MSCs)在大鼠子宮內膜的遷移分布情況，評價PKH26的標記和示蹤效果。方法分離、培養UC-MSCs, 應用PKH26進行細胞標記, 將標記細胞經尾靜脈移植入大鼠體內，熒光顯微鏡下觀察細胞向子宮內膜遷移情況。結果PKH26標記后細胞形態和生長活力無明顯差別，熒光顯微鏡下可見幾乎所有標記細胞呈紅色熒光，主要分布于大鼠子宮內膜腺上皮和間質中。結論PKH26熒光標記是一種安全有效的標記UC-MSCs的方法，可以用于干細胞移植方面的研究。

[關鍵詞]間充質干細胞移植;子宮內膜；細胞標記

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.006

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一類多向分化潛能的成體干細胞，能進行高度自我更新，在體外可以誘導分化為骨骼、肝臟、脂肪、神經等多種組織細胞[1-2]，具有向受損組織歸巢、修復重建病變器官的特點[3-4]。其中人臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesencymal stem cells,UC-MSCs)具有獲取簡便、免疫原性弱、增殖能力強、細胞含量高等優點，已成為組織工程、基因治療和再生醫學研究中理想的干細胞來源。而在干細胞移植的研究中，選擇合適的方法對干細胞進行標記和示蹤是非常重要的。本研究應用PKH26在體外標記培養的UC-MSCs，并將其經尾靜脈途徑移植到大鼠體內，觀察其在子宮內膜遷移情況，評價PKH-26標記和示蹤UC-MSCs的效果，旨在為下一步應用UC-MSCs移植修復子宮內膜損傷奠定實驗基礎。

1材料與方法

1.1標本來源選取2014年3月—2014年5月河北省人民醫院婦產科收治的正常足月剖宮產新生兒臍帶5份。排除母兒各種傳染性疾病及家族遺傳病，獲得產婦及家屬知情同意。

本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2實驗動物、主要試劑及儀器實驗動物采用未交配的SD雌鼠5只，8～10周齡，體質量220～260 g，購自河北省實驗動物中心。主要試劑及儀器有PKH26試劑盒(Sigma公司)、DMEM/F12培養液(Hyclone公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、胰蛋白酶/EDTA消化液(Hyclone公司)、超凈工作臺、熒光顯微鏡、流式細胞儀、培養箱、離心機、無菌培養瓶等。

1.3UC-MSCs的分離、培養無菌取剖宮產新鮮臍帶約10 cm，用生理鹽水洗去臍帶中殘留血液，剪成2～3 cm的小段，再次進行漂洗，從臍帶中間縱行剖開，剔除其內1條臍靜脈、2條臍動脈，剝離華通膠。用眼科剪將華通膠剪碎成1 mm3的小組織塊，轉移至細胞培養瓶中，向其中加入含有體積分數為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養液，在5% CO2、37 ℃的培養箱中靜置培養。用倒置顯微鏡每天觀察細胞生長情況。于1周后首次換液，此后3～4 d換液1次。觀察細胞長至80%～90%融合時，用胰蛋白酶/EDTA消化液消化傳代，在顯微鏡下控制消化時間。

1.4UC-MSCs的鑒定取第3代細胞，達到80%～90%融合時用胰蛋白酶/EDTA消化液消化，制成1×106/mL的細胞懸液，然后用流式細胞儀檢測CD29、CD44、CD90、CD105、CD34、CD45的表達。

1.5用PKH26標記UC-MSCs(組織免疫熒光染色)取經鑒定的UC-MSCs，制成單細胞懸液，DMEM/F12培養液洗滌細胞，加入稀釋液C重懸細胞。按PKH26試劑盒說明書操作，在染色之前，將PKH26 染料應用液(250倍稀釋)置入離心管，然后迅速將細胞液加入PKH26染液中，立即用吸管均勻、快速混合樣品，25 ℃孵育5 min，定時輕輕混勻充分，加入等量血清中止染色反應，孵育1 min，用完全培養液稀釋，離心，去上清，將細胞團轉入新的離心管中，PBS洗滌3次。加10 mL完全培養液，離心，重新懸置細胞至所需濃度,然后在熒光顯微鏡下觀察細胞的染色情況和熒光強度。隨機選取其中5個視野，計算標記率(暗視野下紅色熒光細胞數/明視野下細胞總數)，平均值即為PKH26的即時標記率。

1.6PKH26標記的UC-MSCs在大鼠子宮內膜組織中的示蹤觀察每日固定時間段行大鼠陰道涂片檢查，觀察大鼠動情周期，將PKH26標記的UC-MSCs 1 mL經尾靜脈途徑注射到動情期大鼠體內，于移植后2個動情周期的動情期處死大鼠，取大鼠子宮制成冰凍切片，熒光顯微鏡觀察PKH26標記的UC-MSCs在大鼠子宮內膜組織的分布。

2結果

2.1 UC-MSCs的形態觀察及生長情況從臍帶組織中分離出華通膠，接種后1～2 d組織塊開始貼壁，7 d后可見部分細胞從組織塊周圍爬出，形態呈梭形、紡錘形，局部可成集落生長，14 d左右細胞可形成片狀融合達80%，呈旋渦狀形態生長，即可進行1∶3傳代。細胞傳代后生長能力明顯增強，形態呈現均一的長梭形，類似成纖維細胞，成典型的旋渦狀排列生長(圖1～3)。此外，細胞在增殖傳代過程中形態無明顯變化。

2.2UC-MSCs表面標志物測定用流式細胞儀檢測UC-MSCs的免疫表型，結果看到，原代培養的UC-MSCs能夠高表達CD44、CD90、CD105，但仍然表達一定程度的CD34、CD45，而第3代的UC-MSCs高度表達CD29、CD44、CD90、CD105等間充質細胞標志，幾乎不表達CD34、CD45等造血細胞、內皮細胞標志和主要組織相容性抗原HLA-DR。

2.3UC-MSCs的標記情況經PKH26標記后，UC-MSCs在熒光顯微鏡下觀察呈紅色熒光，細胞輪廓清晰，胞膜完整，紅色染料均勻分布在細胞表面，標記率達100%。繼續培養24 h后觀察，標記細胞貼壁生長，形態良好(圖4)。

2.4標記細胞子宮內膜示蹤觀察PKH26標記的UC-MSCs經尾靜脈移植到大鼠體內，移植后2個動情周期，熒光顯微鏡下可見標記細胞散在分布于子宮內膜間質和腺上皮中，表現呈紅色熒光(圖5)，而未經移植的正常大鼠子宮內膜未見紅色熒光。

圖1 第1代細胞第1天的細胞形態(×100)

Firgure1 CellmorphologyofP1-1d(×100)

圖2 第1代細胞第2天的細胞形態(×100)

Firgure2 CellmorphologyofP1-2d(×100)

圖3 第1代細胞第4天的細胞形態(×100)

Firgure3 CellmorphologyofP1-4d(×100)

圖4 PKH26標記的UC-MSCs(免疫熒光染色×200)

Firgure 4UC-MSCs labeled with PKH26 (immunofluorescence staining ×200)

圖5PKH26標記的UC-MSCs在大鼠子宮內膜組織和腺上皮的分布(免疫熒光染色 ×200)

A、B、C為子宮內膜組織；D、E、F為子宮內膜腺上皮

Firgure 5Distribution of UC-MSCs labeled with PKH26 in endometrial tissue and glandular epithelium(immunofluorescence staining ×200)

3討論

MSCs是來源于中胚層間充質的成體干細胞，具有全能干細胞的特點，能進行多向分化，主要存在于骨髓、臍血、臍帶、外周血等組織中。目前臨床和科研應用MSCs的主要來源是骨髓和臍帶組織。由于骨髓取材困難、有創傷、易污染，且隨著年齡老化細胞數量和分化能力相對減少和減弱，因而限制了其臨床應用。與其相比，人臍帶組織作為“醫療廢物”，取材方便，來源廣泛，不存在倫理問題，且細胞含量高、增殖能力強、免疫原性低，可為實驗和臨床提供充足的MSCs來源[5]。因此，本實驗中采用臍帶組織，從臍帶華通膠中提取MSCs，采取尾靜脈注射方式移植入大鼠體內，觀察干細胞移植后在體內的遷移分化。

為追蹤觀察干細胞移植后在體內的存活、遷移和分布情況，將干細胞加以標記，以便進行識別和監測[6]。目前，常用的細胞標記方法有基因轉染標記法如綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)[7]、熒光染料標記法[8]、熒光原位雜交標記法[9]、核酸標記法如5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU) 、磁共振成像技術[10]、近紅外熒光成像技術[11]、Y染色體標記示蹤、常染色體標記示蹤、循環細胞標記示蹤[12]等。其中，GFP的具體半衰期還未知，不利于在實驗中對時間的掌控，并且一些物理因素(如高溫等)和化學因素(如強酸等)可以破壞它的水化層或雙電層，對其進行降解。BrdU的標記率尚不理想，且細胞凋亡后釋放出的BrdU可能會摻入處于細胞周期S期的任何細胞，使移植細胞和宿主細胞難以辨別，因此可能會出現假陽性結果。磁共振成像技術標記效率高、細胞毒性小，但對試劑和檢測設備要求較高。Y 染色體標記檢測試劑價格昂貴，應用較困難。PKH26是一種親脂性的熒光染料，與細胞膜脂質區發生不可逆的結合，對細胞進行熒光標記，并發出紅色熒光，產生穩定、清晰、精確的熒光標記細胞。既往研究表明，PKH26標記的細胞種類廣，對細胞無明顯的不良反應[13]，不影響細胞增殖、凋亡[14]，標記后的細胞仍保留原有的生物學特性，而且標記強度穩定，具有良好的可重復性，因此目前主要用于細胞體外標記、體外細胞增殖研究及體內外細胞示蹤研究[15]。本研究中對UC-MSCs進行PKH26標記，結果顯示標記細胞和未標記細胞的生長狀態、凋亡周期、增殖能力均無明顯差別，表明PKH26標記后，UC-MSCs的生物學特性無明顯改變，可用于研究UC-MSCs在體內的遷移示蹤。實驗中，將標記細胞經尾靜脈途徑移植入正常大鼠體內，移植后2個動情周期觀察，熒光顯微鏡下可見子宮內膜間質和腺上皮均有紅色熒光標記，而正常大鼠子宮內膜未見紅色熒光標記物，表明PKH26可作為體內示蹤的一項有效標記方法。但本研究中只是采用正常大鼠，尚未對大鼠建立子宮內膜損傷模型，在下一步實驗中我們將應用無水乙醇致使大鼠子宮內膜損傷，應用干細胞進行移植修復，觀察經PKH26標記的干細胞在子宮內膜的示蹤情況。

綜上所述，應用PKH26標記UC-MSCs簡便易行、標記率高、染色速度快、染色后不影響細胞生長特性，可示蹤UC-MSCs在體內的遷移分布情況，為下一步進行干細胞移植修復子宮內膜損傷奠定了實驗基礎。但本實驗僅觀察了細胞移植后2個動情周期的組織形態，沒有進行長期觀察，因此可以在后續的實驗中進一步研究遠期示蹤效果，觀察PKH26的長期示蹤情況。

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(本文編輯：許卓文)

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《河北醫科大學學報》編輯部

Tracing effect of PKH26-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells in endometrium of rats

HAN Hua1， ZHAO Hong-wei2， KANG Jin-sheng3， GAO Hai-xiang4

(1.Department of Obstetrics and Gynecology, the People′s Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang 050051, China; 2.Department of Gastroenterology, the People′s Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050051, China； 3.Department of Neurosurgery, the People′s Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang 050051, China；4.Department of Respiration,the People′s Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang 050051, China)

[Abstract]ObjectiveBy labeling the human umbilical cord mesenchymal stem cells(UC-MSCs) with PKH26, the migration of cell in endometrium of rats were observed. Labeling and tracing effects of PKH26 were evaluated. MethodsIsolated human UC-MSCs were labeled with PKH26.The labeled cells were transplanted to rats through caudal vein. Then the distribution of cells in rat endometrium was observed under fluorescence microscope. ResultsThere were no detectable differences in cell morphology and growth after PKH26 labeling. And the cells were mainly labeled with red fluorescence under inverted fluorescence microscope and were mainly distributed in epithelial cells and stromal cells, in endometrial glandular epithelium and mesenchyme.ConclusionLabeling the human UC-MSCs with PKH26 is a safe and effective method, which can be used in the study of transplantation of stem cells.

[Key words]mesenchymal stem cells; endometrium; cells labeling

[中圖分類號]R617

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)03-0268-04

[作者簡介]韓華(1982-)，女，河北邯鄲人，河北省人民醫院主治醫師，醫學碩士，從事婦產科疾病診治研究。

[基金項目]河北省衛計委青年科技課題(20150122)

[收稿日期]2015-11-18；[修回日期]2015-12-03