HPLC測定注射用奧沙利鉑的含量及有關物質

陳傳喜，楊志勇，袁　紅，王繼平，王大榮

(黃岡市中心醫院腫瘤科，湖北 黃岡　438000)

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◇藥物分析◇

HPLC測定注射用奧沙利鉑的含量及有關物質

陳傳喜，楊志勇，袁紅，王繼平，王大榮

(黃岡市中心醫院腫瘤科，湖北 黃岡438000)

摘要：目的建立注射用奧沙利鉑含量及有關物質的HPLC方法。方法含量和有關物質測定以十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑Zorbax Rx-C(18)(4.6 mm×250 mm)5 μm，以磷酸溶液(取10%磷酸溶液0.6 mL，加水稀釋至1 000 mL，用氫氧化鈉溶液或磷酸調節pH值至3.0)—乙腈=99∶1為流動相，流速0.8 mL·min(-1)，檢測波長209 nm，進樣量20 μL。 結果奧沙利鉑在6～16×10(-3) g·L(-1)濃度范圍內線性關系良好，檢測限為0.02%，回收率為100.55%(RSD=0.46%)，測定樣品含量為99.8%，有關物質均小于0.5%。結論該方法快速，專屬性強，靈敏度高，重現性好，可作為注射用奧沙利鉑的含量及有關物質的檢測方法。

關鍵詞：注射用奧沙利鉑；HPLC法；含量；有關物質

注射用奧沙利鉑是第三代鉑類抗癌藥物，臨床用于治療晚期結、直腸癌，對順鉑耐藥的腫瘤細胞也有一定作用，且毒副作用比順鉑小[1]，與傳統化療藥物或紫杉類藥物間不具交叉耐藥性[2-3]。注射用奧沙利鉑(商品名：樂沙定RR)由瑞士Debiopharm公司研制開發生產，規格為50 mg，于1996年首次在法國上市，現已經在歐盟、美國及我國等多個國家和地區上市多年，臨床應用廣泛。鉑類藥物是晚期癌癥的首選方案，但是早期開發的順鉑和卡鉑具有明顯的交叉耐藥性。奧沙利鉑含有DACH基團空間位阻作用較強，作用機制與順鉑類似，與其他抗癌藥物聯合使用無交叉耐藥性，能有效避免上述缺點。該藥的分子式為C18H14N2O4Pt，分子量397.29，化學名為 (1R-反式)-(1,2-環己二胺-N,N’)[草酸(2-)-O,O’] 合鉑。美國藥典收載了注射用奧沙利鉑的質量標準[4]，中國藥典、英國藥典等均未收載注射用奧沙利鉑的質量標準，國內原有質量標準WS1-(X-090)-2003Z是為奧沙利鉑的無菌凍干品或奧沙利鉑與乳糖的無菌凍干品制定，但研究發現此方法不能將有關物質中的單雜進行控制。本文通過對現有HPLC的條件進行優化，得到快速、準確的測定注射用奧沙利鉑含量及有關物質的方法。

1儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀，配紫外檢測器(Agilent)及安捷倫色譜工作站，電子分析天平(AE240 梅特勒-托利多儀器有限公司)，HDC-S超聲儀(濟寧亨達超聲設備有限公司)。色譜純乙腈(色譜純，TEDIA公司生產)，純化水，氫氧化鈉(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)，磷酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。奧沙利鉑標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號100584-201408)，注射用奧沙利鉑(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：14082247，14082547，14092147，規格50 mg)。

2方法和結果

2.1色譜條件 色譜柱：Zorbax Rx-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：磷酸溶液(取10%磷酸溶液0.6 mL，加水稀釋至1 000 mL，用氫氧化鈉溶液或磷酸調節pH值至3.0)∶乙腈=99∶1為流動相，流速0.8 mL·min-1，檢測波長209 nm，進樣量20 μL；柱溫：30℃。

2.2溶液配制

2.2.1含量測定對照品溶液精密稱取經105℃干燥至恒重的奧沙利鉑對照品25 mg，置250 mL容量瓶中，加適量純化水溶解后，定容至刻度，搖勻，配制成濃度為0.1 g·L-1的對照品溶液，備用。

2.2.2含量測定供試品溶液取供試品注射用奧沙利鉑適量(相當于奧沙利鉑25 mg)，置250 mL容量瓶中，加適量純化水溶解后，定容至刻度，搖勻，配制成濃度為0.1 g·L-1的供試品溶液，備用。

2.2.3有關物質測定供試品溶液稱取“2.2.2”項中注射用奧沙利鉑的粉末適量，精密稱定，置于50 mL的容量瓶中，加入適量蒸餾水溶解，補加蒸餾水定容，搖勻。配制成1 mL中含有約0.01 mg奧沙利鉑的溶液。

2.2.4有關物質對照溶液精密量取“2.2.3”項中的有關物質供試品溶液1 mL，置于100 mL的量瓶中，加入純化水定容至刻度，搖勻。

2.2.5陰性對照溶液稱取甘露醇100 mg、置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，濾過，取適量，稀釋與樣品相同倍數，即得空白輔料溶液。

2.3方法學考察

2.3.1專屬性試驗取“2.2.1”項下奧沙利鉑對照品溶液1 mL，置于100 mL的容量瓶中，加入純化水定容至刻度，充分振搖溶解，精密量取 20 μL進色譜儀，按照上述色譜條件測定，記錄色譜圖。按照上述方法分別取“2.2.2”項下含量供試品溶液、 “2.2.3”項有關物質供試品溶液、“2.2.4”項有關物質對照溶液及“2.2.5”空白輔料溶液各1 mL，稀釋至同等濃度，進色譜儀測定，記錄色譜圖，結果輔料峰未干擾測定(圖1)。

圖1　HPLC色譜圖

注：A.含量測定對照品溶液；B.含量測定供試品溶液；C.有關物質測定供試品溶液；D.有關物質對照溶液；E.陰性對照溶液。

再分別取注射用奧沙利鉑適量，研細，精密稱量粉末(約相當于主藥10 mg)進行如下測試：(1)酸破壞：將精密稱定后的粉末置具塞試管中，加入0.1 mol·L-1鹽酸溶液25 mL，搖勻，置于100℃水浴鍋中4 h，放冷。加入0.1 mol·L-1氫氧化鈉中和并轉移至100 mL的容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，配制成濃度為0.1 g·L-1的溶液，搖勻，過濾。(2)堿破壞：將精密稱定后的粉末置具塞試管中，用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液25 mL溶解，搖勻，置于100℃水浴鍋中4 h，放冷。加入0.1 mol·L-1鹽酸中和并轉移至100 mL的容量瓶中，用流動相稀釋，配制成濃度為0.1 g·L-1的溶液，搖勻，過濾。(3)氧化破壞：將精密稱定后的粉末置具塞試管中，加入30%過氧化氫溶液10 mL，搖勻，放置12 h，加水稀釋至刻度，配制成濃度為0.1 g·L-1的溶液，搖勻，過濾。(4)加熱破壞：將精密稱定后的粉末置具塞試管中，加水稀釋，配制成濃度0.1 g·L-1的溶液25 mL，置于100℃水浴鍋中4 h，放冷，過濾。(5)光破壞：將精密成定后的粉末置具塞試管中，加水稀釋，配置成0.1 g·L-1溶液25 mL，置于強光(5 000 Lx)下照射12 h后，放冷。按照上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結果顯示樣品在經過酸、堿、氧化、加熱、光照破壞后主成分與各降解產物可以達到很好的分離(圖2)。

圖2　降解產物測試HPLC圖

注：F.樣品酸破壞圖譜；G.樣品堿破壞圖譜；H.樣品氧化破壞圖譜；I.樣品加熱破壞圖譜；J.樣品光照破壞圖譜。

2.3.2系統適用性試驗分別精密量取“2.2.1”項中奧沙利鉑對照品溶液、“2.2.2”注射用奧沙利鉑供試品溶液及“2.2.5”項陰性對照溶液20 μL，按照上述色譜條件進樣，色譜柱的理論塔板數按照奧沙利鉑計算不得少于2 000，奧沙利鉑與相鄰雜質峰的分離度不低于2.0。

2.3.3檢測限測定取“2.2.1”項中配制的奧沙利鉑對照溶液，稀釋至50×10-3g·L-1，按照上述色譜條件進樣，根據信噪比法進行試驗，得到的結果：最小檢出量為4×10-6mg(S/N=3)，檢出限為0.02%。

2.3.4線性試驗精密稱量奧沙利鉑對照品25 mg，置于25 mL的容量瓶制備成濃度為1.0 g·L-1的溶液，依次精密吸取0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL，分別置于100 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，得到濃度依次為6.00，8.01，10.01，12.02，14.02，16.02×10-3g·L-1濃度的溶液，按照上述色譜條件取20 μL依次進樣，記錄色譜圖。以奧沙利鉑峰面積Y為縱坐標，以進樣濃度X為橫坐標，得到線性回歸方程為：Y=0.170 1X+0.141 4，r=0.999 8，表明奧沙利鉑在6.00～16.02×10-3g·L-1濃度范圍內呈現良好的線性關系，結果見圖3。

圖3　奧沙利鉑線性關系圖

2.3.5精密度及重復性試驗取“2.2.1”項下奧沙利鉑對照溶液，按照上述色譜條件進樣，重復測定6次，記錄奧沙利鉑的峰面積，計算相標準偏差RSD=0.39%，說明儀器精密度良好。此外，取14082247批次的注射用奧沙利鉑，精密稱量適量的粉末(相當于主藥50 mg)，加水稀釋，配制成濃度為1 g·L-1供試品溶液6份，按照上述色譜條件在同一高效液相色譜儀上分別進樣，記錄奧沙利鉑面積，其含量平均值為99.78%，相對標準偏差RSD=0.42%，顯示重現性良好。

2.3.6回收率試驗按照處方比例稱量適量的輔料，(相當于1瓶制劑的輔料量)，分別加入處方量的80%，100%，120%的奧沙利鉑的對照品，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，每個含量的溶液分別取3份1 mL加流動相稀釋至10 mL作為供試品溶液。精密量取20 μL溶液，按照上述色譜條件進液相儀，記錄圖譜，結果見表1。計算得平均回收率為100.55%，RSD=0.46%。

表1　加樣回收率數據

2.3.7溶液穩定性試驗取供試品溶液，分別在0、6、12、18、24 h精密吸取20 μL進樣，記錄色譜圖，得出峰面積分別為19021、19214、19321、19330、19610，平均峰面積19226，計算其相對標準偏差RSD為0.65%，說明奧沙利鉑在24 h內溶液穩定。

2.4樣品測定

2.4.1有關物質測定取上市品注射用奧沙利鉑1瓶，精密稱量適量粉末(相當于奧沙利鉑50 mg)，置于50 mL的容量瓶中，加水振蕩溶解，補加水稀釋至刻度，搖勻，過濾，濾液作為供試品。取“2.2.1”項中奧沙利鉑對照溶液，稀釋與供試品同等濃度作為對照溶液。精密量取供試品和對照品溶液20 μL進高效液相色譜儀，記錄色譜圖。根據面積歸一化法計算有關物質的峰面積。按照上述方法分別測定3批上市品(批號：14082247，14082547，14092147)中有關物質測定結果分別為0.35%，0.33%，0.36%。

2.4.2含量測定取上市品注射用奧沙利鉑1瓶，精密稱量適量粉末(約相當于主藥10 mg)，置于100 mL的容量瓶中，加水溶解，補加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品。取“2.2.1”項中奧沙利鉑對照溶液稀釋與供試品同等濃度作為對照溶液。精密量取20 μL對照品與供試品溶液，進高效液相色譜儀，記錄圖譜。按照外標法分別測定3批上市品(批號：14082247，14082547，14092147)中含量分別為99.8%，99.9%，99.8%。

3討論

在對上市品有關物質及含量方法學的研究過程中[5-6]，按照國內藥品標準[7]研究發現此條件不能有效的將有關物質進行分離，分離度不足1.5，不能作為檢測有關物質的條件進行測定。

本研究通過調整流動相的比例和流速，嘗試使用Alltima-C18、Zorbax Rx-C18、HP-35-C18柱在分離度、理論塔板數、拖尾因子等方面綜合考量，Zorbax Rx-C18柱具有能有效分離奧沙利鉑的有關物質草酸及其他雜質，出峰時間合理。另外通過專屬性研究酸、堿、高溫、氧化破壞的雜質及對照品最大的吸收峰均在209 nm，此波長可以將主成分及有關物質較為靈敏的檢測出。

通過測定的結果顯示在以下條件：磷酸溶液(1 mL磷酸，加水至1 000 mL即得)—乙腈(99∶1)；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：209 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30℃，主峰和輔料、有關物質達到基線分離要求，色譜峰形對稱符合檢測要求。

參考文獻：

[1]王彥美,韓杰,周邵兵,等.鉑抗癌藥物研究進展[J].合成化學,2003,11(1):27-31.

[2]張文.晚期結直腸癌的化療進展[J].中國癌癥雜志,2004,14(4):380.

[3]楊柳青,秦叔逵.第3代鉑類藥物洛鉑的研究新進展[J].臨床腫瘤學雜志,2009,14(12)：1134-1139.

[4]United States Pharmacopoeia(31)[S],2015:2696.

[5]徐靜,張偉明,李健和,等.奧沙利鉑靜脈輸液的有關物質檢查與含量測定[J].中國藥業，2013,22(15):48-50.

[6]閆占寬,李語如,宋曉光,等.高效液相色譜法測定奧沙利鉑注射液中奧沙利鉑的含量和有關物質[J].東華理工大學學報,2010,33(3):290-292.

[7]國家藥品標準. 注射用奧沙利鉑藥品注冊標準[S]，2003.

Determination of content and related substances of Oxaliplatin for Injection by HPLC

CHEN Chuan-xi,YANG Zhi-yong,YUAN Hong,et al

(DepartmentofOncology,HuanggangCentralHospital,Hubei438000,China))

Abstract:ObjectiveTo establish an HPLC method to determine the oxaliplatin content and the related substances of oxaliplatin for injection. Methods The chromatographic separation was performed on Zorbax Rx-C(18)(4.6 mm×250 mm，5 μm)that was made by alkyl-bonded silica gels,phosphoric acid solution(10% phosphoric acid solution 0.6 mL,diluted with water to 1 000 mL,pH adjusted to 3.0 with sodium hydroxide solution or phosphoric acid)- acetonitrile=99∶1; the flow rate was 0.8 mL·min(-1);the detection wavelength was 209 nm; the sample size was 20 μL.Results The linear of oxaliplatin was 6～16×10(-3) g·L(-1). The limits of detection was 0.02%. The average recovery was 100.55%(RSD=0.46%). Determination of the sample average content was 99.8%,and the related substance was less than 0.5%.Conclusions The method is rapid,specific,sensitive,and well repeatable,which can be used to determine the content of oxaliplatin for injection and its related substances.

Key words:oxaliplatin for injection;HPLC;content;related substance

(收稿日期：2015-10-23，修回日期：2016-01-18)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.012