高壓氧治療對于急性腦梗死患者外周血單核細胞Toll樣受體4的表達及預后的影響

雷　蕾，周志斌，姜　丹，彭　軍

(武漢科技大學附屬天佑醫院神經內科，湖北 武漢　430064)

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高壓氧治療對于急性腦梗死患者外周血單核細胞Toll樣受體4的表達及預后的影響

雷蕾，周志斌，姜丹，彭軍

(武漢科技大學附屬天佑醫院神經內科，湖北 武漢430064)

摘要：目的觀察高壓氧治療對于急性腦梗死患者外周血單核細胞(PBMCs) Toll樣受體4 (TLR-4)mRNA的表達及神經功能康復的影響。方法入選58例腦梗死患者，隨機分為對照組和高壓氧治療組，兩組患者均予常規藥物治療，高壓氧治療組在常規治療基礎上予以高壓氧治療。另入選25例健康體檢者為健康對照組(正常組)，高壓氧治療前、治療第5、10天分離兩組患者PBMCs，熒光定量RT-PCR法檢測TLR-4mRNA表達。高壓氧治療前、治療第5、10天及起病21 d患者隨訪進行美國國立衛生院神經功能缺損評分(NIHSS)及日常生活能力(ADL)評分。結果腦梗死患者(對照組，高壓氧治療組)起病時外周血單核細胞TLR-4mRNA的表達均顯著高于正常組，治療后兩組患者外周血TLR-4mRNA表達均下降，高壓氧治療組顯著低于對照組。高壓氧治療組治療第10天及起病21 d后NIHSS評分均顯著低于對照組，ADL評分則高于對照組。結論高壓氧治療顯著降低急性腦梗死患者外周血TLR-4mRNA的表達，減輕腦損傷后繼發性炎癥反應，促進神經功能的恢復，改善預后。

關鍵詞:高壓氧；腦梗死；Toll樣受體4；神經功能預后

Toll樣受體(Toll-like receptor ,TLR)是天然免疫中重要的病原體識別受體，可介導炎性因子的釋放和免疫細胞激活，進而誘導獲得免疫[1]。作為TLR家族成員之一，TLR-4信號轉導通路在腦梗死等非病原微生物性炎癥損傷過程中發揮著十分重要的作用,其參與介導腦缺血炎性損傷，促進腦缺血再灌注損害，而TLR-4基因缺失時則表現出對腦組織的保護作用[2]。高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)治療則可有效減輕腦缺血再灌注損傷的炎癥反應，減少神經細胞的繼發性死亡[3-4]。本研究通過觀察急性腦梗死患者HBO治療前后外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)TLR-4mRNA的表達及神經功能康復情況，進一步探討其在神經保護機制中的作用，為臨床治療提供依據。

1資料與方法

1.1研究對象選擇自2014年1月至2014年12月本院神經內科住院的診斷為急性腦梗死的患者58例,男35例,女23例,年齡(62.7±12.9)歲。均為初次發病,入院時間在起病72 h以內。所有病例均符合1995 年全國第4 屆腦血管病學術會議修訂的腦梗死標準[5],均經頭顱計算機體層掃描(computerized tomography,CT)或磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI) 檢查確診?；颊呔浽敿毜纳窠浵到y體檢及常規實驗室檢查(心電圖、胸片、肝腎功能、凝血功能、血常規等)。排除標準:明顯的肝腎功能障礙,感染或惡性疾病患者，肺大泡、氣胸、慢性阻塞性肺病患者，血壓超過180/110 mmHg的患者。將患者隨機分為對照組和高壓氧治療組(隨機數字表法)。本研究經過武漢科技大學附屬天佑醫院倫理委員會批準，所有患者均充分告知知情同意，并簽署知情同意書。兩組患者年齡、性別、吸煙、飲酒、血壓、血脂等危險因素以及神經功能評分、日常生活能力評分方面差異均無統計學意義(表1)，另取25名健康體檢者為健康對照組。

1.2研究方法兩組患者均根據中國急性缺血性卒中診治指南2010[6]推薦行常規抗血小板聚集、腦保護、調脂、調控血壓對癥治療，高壓氧治療組在常規治療基礎上，入院后24 h內予高壓氧治療。采用GY3200型多人氧艙，治療方案：加壓艙壓力取 0.1 MPa，采用間斷吸氧，階段性吸氧20 min×3，吸氧過程中休息5 min×2，連續治療10次為1個療程。高壓氧治療前、治療第5天，10 d分離其PBMCs，熒光定量RT-PCR法檢測TLR-4mRNA表達。治療前、治療第5天，10天及起病21 d對患者隨訪進行美國國立衛生院神經功能缺損評分(the National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)，采用Barthel指數(Barthel Index，BI)評分進行日常生活能力(activities ofdaily living，ADL)評定。

1.3人外周血單核細胞的分離取清晨空腹外周靜脈血10 mL，肝素抗凝，以Ficoll密度梯度離心法分離外周血單核細胞。PBS(pH7.4)洗滌細胞2次，臺盼藍排斥實驗示細胞存活率為98%，入Trizol中混勻，與血漿標本分別置入-70℃冰箱保存備用。

1.4熒光定量RT-PCR Trizol法提取各組細胞總RNA。行實時定量PCR擴增,以β-actin為內參，反應體系為: cDNA 1 μL、2× SYBR Green PCR Master mix12.5 μL、上下游引物各100 nm、ddH2O 滅補足至25 μL。擴增的反應條件: 95℃5 min, 94℃ 20 s,56℃ 20 s, 72℃ 20 s, 72℃ 5 min,55℃ 10 s,40個循環。循環結束后進行融點曲線分析，于60～95℃之間進行測定，(升溫幅度：0.5℃/次，5秒/次)。引物序列如下TLR-4：上游5’-acatcaaatgcccctactca-3’，下游5’-ctaaaccagccagaccttga-3’; β-actin：上游5’-cattaaggagaagctgtgct-3’,下游5’-gttgaaggtagtttcgtgga-3’。反應結束后，根據Ct值通過公式2-ΔΔCt分析計算各目的基因相對表達量。

2結果

2.1各組患者基線臨床資料比較實驗組與對照組兩組患者年齡、性別構成、吸煙、高血壓、糖尿病、高脂血癥等危險因素以及NIHSS評分、ADL評分方面差異均無統計學意義；與正常組比較，年齡、性別構成差異無無統計學意義(表1)。

表1　各組患者一般臨床資料比較

注：高血壓：指需要治療的高血壓患者；糖尿?。盒枰委?包括飲食控制)的胰島素依賴和非胰島素依賴的糖尿病患者。高脂血癥：根據本院實驗室診斷標準診斷膽固醇或甘油三酯水平增高的患者。

2.2高壓氧治療對于患者外周血單核細胞TLR-4mRNA的表達的影響高壓氧治療前(0 d)，急性腦梗死患者(高壓氧組，對照組)外周血單核細胞TLR-4mRNA顯著高于正常組，高壓氧組第5天外周血單核細胞TLR-4mRNA較0 d下降。高壓氧治療第10天，高壓氧組，對照組外周血單核細胞TLR-4mRNA均較0 d下降，高壓氧治療組下降至基線水平(正常組)，顯著低于對照組(圖1)。

2.3各組患者治療前后NIHSS、ADL評分高壓氧治療組患者在高壓氧治療10 d及起病21 d后NIHSS評分及ADL評分均優于對照組，并且隨著治療時間延長，改善愈明顯。但在治療第5天兩組差異無統計學意義。見表2。

圖1　各組患者外周血單核細胞TLR-4mRNA的表達

注：與健康對照組相比,*P<0.01，同時間與對照組相比,△P<0.01,與第5天對照組相比,§P<0.01。

表2　高壓氧組與對照組治療前后NIHSS、ADL評分比較

3討論

腦缺血再灌注導致的炎性反應參與了腦損傷過程[7]，炎癥免疫反應是腦缺血再灌注損傷的重要機制。過度炎癥免疫是包括腦梗死在內的多臟器缺血再灌注損傷等病理情況的共同標志，而TLR-4在病原菌介導的炎癥及非感染性炎癥中均起著重要的作用。TLR-4在中樞神經主要表達在小膠質細胞，在中樞神經系統損傷中發揮關鍵作用， 損傷介質主要來源于小膠質細胞。腦組織發生缺血后，缺血血管、受損腦細胞以及細胞外基質可以釋放一些蛋白分子，如釋放熱休克蛋白、透明質酸、防御素和彈性蛋白酶，這些內源性激活物作為內源性配體與 TLR4受體相互結合，通過MAPK/NF-κB和NF-κB/IRF3等信號轉導途徑，啟動免疫反應，誘導產生TNF-α、IL-6、IL-113等多種炎性因子、趨化因子等"級聯式"釋放，產生炎癥反應，參與介導并加重腦缺血炎性損傷[8-9]。

腦缺血動物實驗研究表明，TLR-4缺陷小鼠腦缺血再灌注后的梗死體積較野生型小鼠顯著縮小。TLR-4基因小鼠的腦缺血后炎性反應和腦損害有所減輕。Caso等[10]通過建立小鼠大腦中動脈栓塞動物模型，研究發現，與對照組相比(野生小鼠)，TLR-4基因敲除小鼠腦梗死體積較小，炎癥反應較輕，血清TNF-α和IL-6、干擾素調節因子1等炎性因子明顯降低，神經功能及行為功能恢復結果較好，推論其發生的機制可能是由于TLR-4缺陷，導致其介導的炎性信號通路被阻斷或抑制，降低了免疫反應和組織損害程度。Brea等[11]應用流式細胞儀檢測腦梗死急性期患者外周血單核細胞TLR-4的表達，發現其與患者預后獨立相關，預后較差的患者TLR-4的表達顯著增高，同時其血清TNF-α、IL-1β、IL-6、 VCAM-1等炎性因子表達水平同步顯著增高，TLR-4表達與TNF-α、IL-1β、IL-6、 VCAM-1水平呈正相關。TLR-4表達與腦梗死體積獨立正相關。本研究亦表明急性腦梗死患者急性期外周血單核細胞TLR-4mRNA表達較健康對照組顯著增高。TLR-4mRNA增高的機制可能是腦梗死時腦組織缺血缺氧，導致血管內皮通透性增高及壞死物質釋放，TLR-4啟動免疫反應，通過其信號通路引起TNF-α等炎性因子分泌增多，參與介導腦缺血炎性損傷。同時可吸引富含TLR-4表達的外源性的單核巨噬細胞、淋巴細胞等炎性趨化聚集，成為加劇炎性損傷的效應細胞。

大量動物實驗及臨床觀察表明高壓氧治療在腦梗死患者神經功能恢復方面發揮著積極作用，是治療缺血性腦血管病的一種有潛力的物理療法。但其作用機制尚未明確。其腦保護機制大致有如下幾點[12-13]：(1)提高血氧分壓與血氧含量，改善微循環，改善代謝，增加組織內氧的彌散，迅速改善病灶供氧及代謝，減少酸性代謝物質；(2)維護血腦屏障的完整性，降低血腦屏障通透性減少血液中水分向組織滲透，減輕組織水腫，降低顱內壓；(3)抑制興奮性氨基酸毒性作用，及抑制海馬一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS) mRNA 的表達，抑制神經元凋亡；(4)清除腦組織自由基，加強組織抗氧化能力，減輕腦缺血再灌注損傷的炎癥反應；(5)降低血液黏滯度，減輕血小板的聚集，有利于缺氧腦區血液循環的恢復。

本研究表明，雖然在高壓氧治療第5天，高壓氧治療組與對照組兩組NIHSS評分及ADL評分無統計學差異，但在高壓氧治療第10天及起病21 d后，高壓氧治療組患者NIHSS評分及ADL評分均優于對照組，并且隨著治療時間延長，改善愈明顯。表明高壓氧治療可有效改善患者遠期預后。同時高壓氧治療組顯著抑制患者外周血單核細胞TLR-4mRNA表達的增高，治療10 d時基本恢復至基線水平。徐江等[14]研究表明高壓氧治療可顯著抑制腦缺血再灌注大鼠腦組織NF-κB 的活性和 ICAM-1 的表達的增高，減少腦梗死的體積。本研究表明高壓氧治療可抑制腦梗死患者外周血TLR-4的表達，而TLR-4位于NF-κB等炎性信號傳導途徑的上游，這可能是其高壓氧治療減輕腦缺血再灌注損傷的炎癥反應機制之一。

總之，本研究表明高壓氧治療可通過抑制TLR-4的表達，減輕腦損傷后繼發性炎癥反應，促進缺血性腦血管病患者神經功能的恢復，改善預后。

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Effects of hyperbaric oxygen on the rehabilitation of nervous function and expression of Toll-like receptor4 mRNA on peripheral blood mononuclear cells in patients with acute cerebral infarction

LEI Lei, ZHOU Zhi-bin, JIANG Dan, et al

(DepartmentofNeurology,TianyouHospitalAffiliatedtoWuhanUniversityofTechnology,Wuhan,Hubei430064,China)

Abstract:Objective To investigate the effects of hyperbaric oxygen(HBO) on the rehabilitation of nervous function and expression of Toll-like receptor4(TLR-4)mRNA on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in serum in patients with acute cerebral infarction.Methods The 58 patients with acute cerebral infarction were randomized into control group and HBO group. All patients were undergoing conventional medical treatment, and HBO group also received HBO therapy. In addition, 25 health controls were included. The expression of TLR-4 mRNA on PBMCs from 80 patients were measured by real time quantitative RT-PCR before and on the 5th ,10th day of HBO treatment. The National Institutes of Health stroke scale(NIHSS) and the Barthel index(BI) were also used for evaluation before and on the 5th，10th day of HBO treatment，and 21st day after onset.ResultsThe expression of TLR-4 on PBMCs in patients with acute cerebral infarction was significantly increased compared to health controls (P< 0.01) on the onset. After treatment, it declined, and HBO group was significantly lower than control group.On the 10th day of treatment，and 21st day after onset，in HBO group，NIHSS scores were significantly lower while BI scores were significantly higher than control group(P< 0.01) . Conclusions The expression of TLR-4 mRNA on PBMCs of acute cerebral patients can be significantly depressed by HBO therapy, which decreases inflammatory reaction secondary to cerebral injury, promotes rehabilitation of nervous function and improves the outcome.

Key words:hyperbaric oxygen；cerebral infarction；Toll-like receptor4；nervous function；outcome

(收稿日期：2015-08-17，修回日期：2015-11-21)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.026