通天草提取物對大鼠肝纖維化的影響和機制

李　林　孫　超　郭　家　張曉杰

(齊齊哈爾醫學院，黑龍江　齊齊哈爾　161006)

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·基礎研究·

通天草提取物對大鼠肝纖維化的影響和機制

李林孫超郭家張曉杰

(齊齊哈爾醫學院，黑龍江齊齊哈爾161006)

〔摘要〕目的探討通天草提取物(AEWH)對CCl4誘導大鼠肝纖維化(LF)的影響和機制。方法SD大鼠隨機分成對照組，模型組，治療組(秋水仙堿0.001 g/kg)，AEWH高、中、低劑量組(AEWH 3、1.5、0.75 g/kg)。采用40% CCl4(1 ml/kg)腹腔注射誘導LF大鼠模型。放射免疫法檢測大鼠血清透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)和Ⅳ型膠原(CⅣ)水平。生化分析法檢測血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)水平。電子顯微鏡觀察大鼠肝組織鏡下形態結構并計算肝臟臟器指數。酶聯免疫法檢測肝臟中轉化生長因子(TGF)-β1和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平。結果與模型組比較，AEWH高、中劑量組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ、ALT和AST明顯降低(P<0.05)，TP和ALB明顯升高(P<0.05)，大鼠肝臟病理纖維化明顯減輕，肝臟臟器指數明顯降低(P<0.05)，肝TGF-β1和TNF-α明顯降低(P<0.05)。結論AEWH可減輕CCl4誘導LF大鼠肝臟損傷，降低LF程度。AEWH治療LF的機制與抑制大鼠肝臟TGF-β1和TNF-α表達有關。

〔關鍵詞〕通天草提取物；肝纖維化；腫瘤壞死因子-α

乙型肝炎病毒〔1〕、長期大量飲酒等因素〔2〕可刺激肝巨噬細胞激活，進而分泌轉化生長因子(TGF)-β1、腫瘤壞死因子(TNF)-α等，作用于肝星狀細胞使其轉化為肌成纖維細胞，分泌細胞外基質，沉積于肝內而演化成肝纖維化(LF)〔3,4〕。細胞外基質的過度沉積與膠原組織的降解產物血清透明質酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)等有關。LF伴有谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)異常，肝功能降低。目前LF治療藥物包括TGF-β1拮抗劑、環氧化酶抑制劑等，藥物劑量過大有副作用，因此探尋多靶點、毒副作用小的祖國醫藥迫在眉睫。課題組前期研究表明通天草水提物(AEWH)可改善阿爾茨海默病(AD)小鼠海馬白介素(IL)-1β〔5〕、保護AD大鼠腦組織〔6〕、改善AD大鼠海馬結構〔7〕、改善學習記憶〔8〕、增強AD大鼠抗氧化能力〔9〕、上調AD大鼠海馬5-羥色胺表達〔10〕、調節AD大鼠腦IL-6和TNF-α水平〔11〕，改善AD大鼠核轉錄因子-κB表達〔12〕。因此本實驗擬探討AEWH對LF大鼠模型的影響及機制。

1材料和方法

1.1藥品和試劑秋水仙堿(西雙版納版納藥業有限責任公司，批號140808)。通天草由黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院周忠光教授購買，田明教授制備成通天草提取物(AEWH)水煎劑、烘干后制備成干粉、-20℃冰箱保存。使用AEWH時需要加熱，臨時配制成溶液，給予大鼠灌胃治療。血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ試劑盒，ALT、AST、TP和ALB試劑盒，肝組織TNF-α和TGF-β1酶聯免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所)，CCl4和其他試劑均為國產分析純，由齊齊哈爾醫學院張英博副主任醫師提供。

1.2動物清潔級雄性健康SD大鼠，體重(240±30)g，黑龍江中醫藥大學實驗動物中心李寶龍副主任提供，合格證：SCXK(黑)2013-004。

1.3儀器6100型RT-雷杜酶標儀(美國RT公司)，EM-1200EX型透射電鏡(日本Jeol),CM1900冰凍切片機(Leica公司)，TGL-16G型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，電子天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司)，超凈工作臺(中國上海精密儀器儀表公司)等。

1.4LF模型復制實驗參考文獻〔13〕制備LF大鼠模型。制備過程：采用40% CCl4(1 ml/kg)腹腔注射SD大鼠誘導LF大鼠模型，每周對大鼠注射2次，共8 w。通過大鼠尾靜脈采血，檢驗大鼠血清學指標，確認LF大鼠模型制備成功。對照組采用同樣方法腹腔注射等量100%橄欖油。

1.5動物分組與處理SD大鼠48只隨機分成對照組，模型組，治療組，AEWH高、中、低劑量組，每組8只。對照組、模型組灌胃等量生理鹽水，治療組灌胃秋水仙堿0.001 g/kg，AEWH高、中、低劑量組灌胃AEWH 3、1.5、0.75 g/kg，灌胃35 d。

1.6血清LF指標SD大鼠灌胃結束后禁食20 h，眼球采血，靜置，分層，3 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝，-80℃保存。按照試劑盒說明書采用放射性免疫法檢測血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ水平。

1.7檢測肝功能指標各組大鼠灌胃結束后禁食20 h，眼球采血，靜置，2 500 r/min離心15 min，取上清，分裝，-80℃冰箱保存。血清生化指標ALT、AST、TP和ALB分別按照試劑盒說明書進行操作。

1.8透射電鏡觀察肝組織實驗結束后，心臟灌注150 ml生理鹽水，然后再用2.5%戊二醛灌注，取材大鼠肝部位、2.5%戊二醛固定、四氧化鋨固定、脫水、包埋、切片等過程，透射電鏡觀察肝組織結構。

1.9測定肝臟臟器指數實驗結束后，迅速斷頭處死各組大鼠，取材大鼠肝臟，電子天平稱重，計算臟器指數。臟器指數(mg/g)=臟器質量(mg)/體重(g)。

1.10檢測肝組織TGF-β1和TNF-α大鼠灌胃結束后斷頭處死，超凈工作臺上取肝組織，生理鹽水洗滌，剪碎，勻漿，靜置，離心，取上清，分裝，-80℃保存。6100型RT-雷杜酶標儀450 nm波長測定各孔吸光度(A)，根據標準曲線求得方程，計算肝組織TGF-β1和TNF-α含量。

1.11統計學分析采用SPSS19.0統計學分析軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1血清LF指標與對照組比較，模型組LF大鼠血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ含量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，治療組、AEWH高中劑量組LF大鼠血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ含量明顯降低(P<0.05)，而AEWH低劑量組大鼠血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ含量改變不明顯(P>0.05)。見表1。

2.2血清肝功能指標與對照組比較，模型組大鼠ALT和AST含量明顯升高(P<0.05)，TP和ALB含量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，治療組、AEWH高、中劑量組LF大鼠ALT和AST含量明顯降低(P<0.05)，TP和ALB含量明顯升高(P<0.05)，而AEWH低劑量組大鼠血清ALT、AST、TP和ALB改變不明顯(P>0.05)。見表2。

表1　AEWH對LF大鼠血清HA、LN、PCⅢ和

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下表同

表2　AEWH對LF大鼠血清ALT、AST、TP和

2.3透射電鏡觀察肝組織透射電鏡觀察可見對照組肝細胞的細胞質內線粒體豐富，線粒體未見腫脹，肝細胞核膜清晰；模型組肝細胞的線粒體減少，脂滴較多；治療組、AEWH高、中劑量組肝細胞的細胞器比較豐富，脂滴較少，線粒體較少；AEWH低劑量組肝細胞糖原較多，脂滴較多。見圖1。

A：對照組；B：模型組；C：秋水仙堿組；D：AEWH高劑量組；E：AEWH中劑量組；F：AEWH低劑量組圖1　AEWH對LF大鼠肝細胞質超微結構的影響(透射電鏡，× 16 500)

2.4肝指數與對照組比較，模型組LF大鼠肝指數明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組、AEWH高、中劑量組LF大鼠肝指數明顯降低(P<0.05)，AEWH低劑量組大鼠肝指數改變不明顯(P>0.05)。見表3。

表3　AEWH對LF大鼠肝指數的影響

2.5肝組織TGF-β1和TNF-α通過標準曲線求得TGF-β1的方程是Y=0.098 7X+ 0.112 6，R2=0.994 2；TNF-α的方程是Y=0.019 4X + 0.143 4，R2=0.982 0。與對照組比較，模型組LF大鼠肝組織TGF-β1和TNF-α明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組、AEWH高、中劑量組大鼠肝組織TGF-β1、TNF-α明顯降低(P<0.05)，AEWH低劑量組大鼠肝組織TGF-β1、TNF-α改變不明顯(P>0.05)。見表4。

表4　AEWH對LF大鼠肝組織TGF-β1、

3討論

HA、LN、PCⅢ和CⅣ是細胞外基質的降解產物，實驗結果表明，模型組膠原纖維增加，LF模型穩定。AEWH高中劑量可改善大鼠模型肝組織LF程度，減少肝細胞外基質，減少膠原的含量，而低劑量AEWH對LF指標的改善作用較小。

血清肝功能指標ALT、AST、TP和ALB可直接反映肝臟合成功能及儲備能力，實驗結果表明，模型組大鼠肝細胞破壞，存在肝細胞內的大量因子通過破壞的肝細胞膜進入到血清中，同時肝臟的合成功能和儲備功能下降。AEWH高中劑量可改善肝細胞膜通透性，同時肝合成功能得到恢復，顯示模型大鼠肝功能得到恢復，而低劑量AEWH對肝功能指標的改善效果較差。

透射電鏡觀察可見對照組肝組織結構正常。而模型組肝細胞的功能低下，防御和解毒的能力較弱，模型穩定。經過治療后，AEWH高中劑量可改善LF大鼠模型的組織病變，低劑量AEWH治療效果較差。

實驗還測定了肝指數，評價肝組織的損傷程度。結果表明LF模型大鼠肝臟質量增加，提示LF模型大鼠肝組織損傷明顯，出現肝組織代償性增生。經過治療后，AEWH高中劑量組LF大鼠肝指數降低，說明肝臟質量減輕，提示AEWH高中劑量可不同程度地增加對肝臟的保護作用。

機體在促LF因子TGF-β1和TNF-α作用下，刺激成纖維細胞增生，增加和合成膠原纖維，加速肝細胞之間的細胞外基質沉積，最終引起LF。實驗結果表明，模型組成纖維細胞數量增加，肝細胞之間的細胞外基質增加，肝星狀細胞大量增殖，提示LF大鼠模型穩定。AEWH高、中劑量可干擾成纖維細胞生成，減少肝星狀細胞的增殖，減輕大鼠LF程度。 TGF-β1和TNF-α的變化趨勢與LF指標及其肝功能指標的變化趨勢相同，提示AEWH高、中劑量通過改善TGF-β1和TNF-α來治療LF。

4參考文獻

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〔2016-01-03修回〕

(編輯曲莉)

Effect of Aqueous extract from Waternut herb on liver fibrosis rats and its mechanism

LI Lin，SUN Chao，GUO Jia,etal.

Qiqihaer Medical University, Qiqihaer 161006，Heilongjiang, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effects of Aqueous extract from Waternut herb (AEWH) against liver fibrosis induced by CCl4 in rats and their mechanism.MethodsSprague-Dawley rats were randomly divided into control，model，treatment (colchicine 0.001 g/kg)，AEWH high-, medial-, low-dose (AEWH 3, 1.5 and 0.75 g/kg) groups. Liver fibrosis model rat was induced by intraperitoneal injection of 40% CCl4 (1 ml/kg). The radioimmunoassay was used to determine hyaluronic acid (HA)，laminin (LN)，procollagen Ⅲ (PCⅢ) and Ⅳ collagen(CⅣ) levels in serum of rats. The biochemical analysis was used to determine alanine aminotransferase (ALT)，aspartate aminotransferase (AST)，total protein (TP) and albumin (ALB) levels in serum of rats. After the treatment all animals were sacrificed, morphology of liver tissue was observed by optical electron microscopy to calculate the organ coefficients of liver. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was applied for detecting transforming growth factor (TGF)-β1 and tumor necrosis factor (TNF)-α levels in the liver.ResultsCompared with the model group， HA，LN，PC-Ⅲ，CⅣ，ALT and AST in serum of rats were significantly decreased(P<0.05)；TP and ALB in serum of rats were significantly increased (P<0.05)；the liver pathological variations of fibrotic rats were obvious；organ coefficients of liver were significantly decreased (P<0.05)；TGF-β1 and TNF-α in the liver of rats were significantly decreased (P<0.05) in AEWH high-dose and medial-dose groups.ConclusionsAEWH could attenuate the CCl4-induced immunological liver injury and the fibrosis level in rats. The mechanisms possibly contribute to down-regulation expression of TGF-β1 and TNF-α in liver of rats.

【Key words】Aqueous extract from Waternut herb；Liver fibrosis；Tumor necrosis factor-α

〔中圖分類號〕R285

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1537-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.001

通訊作者：張曉杰(1965-)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事肝纖維化、抑郁癥、癡呆研究。

基金項目：國家自然科學基金(81173576)；黑龍江省自然科學基金(H201354)；黑龍江省教育廳基金(12521624，12531788，12531790)

第一作者：李林(1978-)，男，講師，碩士，主要從事肝纖維化、抑郁癥、癡呆研究。