1,8-桉油素預處理對Aβ25~35誘導大鼠皮層神經元炎癥反應的影響

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1,8-桉油素預處理對Aβ25~35誘導大鼠皮層神經元炎癥反應的影響

第一作者：王琳(1979-)，女，碩士，講師，主要從事神經及內分泌藥理學研究。

王琳趙春貞

(濰坊醫學院藥理學教研室應用藥理學實驗室，山東濰坊261053)

〔摘要〕目的探討1,8-桉油素預處理對Aβ(25~35)誘導原代培養大鼠皮層神經元炎癥反應的影響。方法原代培養大鼠皮層神經元，隨機分組。采用噻唑藍(MTT)還原反應觀察神經元損傷；以Aβ(25~35)處理24 h誘導神經元損傷；酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測上清液中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β及半胱氨酰白三烯(CysLTs)釋放水平。結果20 μmol/L的Aβ(25~35)處理神經元細胞24 h可顯著降低神經元活性，增加TNF-α、IL-1β及CysLTs的釋放，1,8-桉油素10 μmol/L預處理后可明顯抑制Aβ(25~35)引起的細胞毒性效應，并抑制上述炎癥因子及CysLTs的釋放。結論1,8-桉油素對Aβ(25~35)誘導的神經元損傷具有保護作用，與抑制TNF-α、IL-1β及CysLTs的釋放有關。

〔關鍵詞〕1,8-桉油素，阿爾茨海默病，炎癥，細胞因子

阿爾茨海默病(AD)是一種病因未明的神經退行性疾病，以神經細胞之間大量老年斑沉積β淀粉樣蛋白(Aβ)和神經細胞內神經元纖維纏結為主要病理學特征〔1〕。大量研究表明〔2〕，Aβ沉積誘導AD患者腦內炎癥的發生，導致前炎癥因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β等的大量釋放，并通過一氧化氮合成酶2或核轉錄因子(NF)-κB進一步加速炎癥進程。TNF-α，IL-6等多種炎癥因子均能通過調節γ-分泌酶的活性促進Aβ在神經元內的產生〔3〕。1,8-桉油素是一種從桃金娘科植物藍桉中提取出的揮發油的主要活性成分。在人單核細胞和淋巴細胞中，它能夠明顯抑制TNF-α和IL-1β等炎癥因子的釋放〔4〕。臨床試驗表明，1,8-桉油素能夠減輕哮喘患者的炎癥反應〔5〕。然而，它對AD的作用尚不清楚。本實驗采用Aβ25~35誘導原代培養的神經元損傷，觀察1,8-桉油素對炎癥反應的影響。

1材料與方法

1.1藥物與試劑1,8-桉油素，分子量為154.25 kD，購自美國Sigma公司；DMEM培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司；馬血清購自美國Gibco公司；噻唑藍(MTT)購自美國Sigma公司；TNF-α和IL-1β試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；CysLTs試劑盒購自美國Cayman Chemical公司。

1.2原代神經元培養取24 h內新生大鼠，經75%乙醇消毒后斷頭取腦，于預冷的解剖液中分離左右半球，分離大腦皮層后剪碎，制成細胞懸液。調整細胞密度為1×109ml，接種到經0.1%多聚賴氨酸涂板干燥的96孔或24孔板中，并將種植液換成培養液。每2~3 d換液1次，到培養第5天，加入終濃度為10 μmol/L的阿糖胞苷，抑制非神經元的生長，24 h后換成新鮮的培養液繼續培養7 d后用于各項實驗。

1.3Aβ25~35處理將1 μg Aβ25~35加無菌生理鹽水溶解后，配成280 μmol/L的母液分裝，于-20℃保存。使用前置于37℃培養箱內孵育1 w，使其聚集老化。

1.4實驗分組將原代神經元隨機分組：對照組，加入一定體積的細胞培養液，不做任何干預；模型組：加入終濃度為20 μmol/L的Aβ25~35作用24 h；1,8-桉油素低劑量組，加入終濃度為1 μmol/L的1,8-桉油素預處理1 h后，再加入終濃度為20 μmol/L的Aβ25~35處理24 h；1,8-桉油素高劑量組，加入終濃度為10 μmol/L的1,8-桉油素預處理1 h后，再加入終濃度為20 μmol/L的Aβ25~35處理24 h。

1.5細胞活性測定將神經元處理后，小心棄去培養液，加入MTT液(0.5 g/L)，放回到CO2孵箱內37 ℃孵育4 h，加入DMSO 100 μl，振蕩搖勻使紫色結晶充分溶解，置于酶標儀上測波長為570 nm的吸光度。

1.6酶聯免疫吸附(ELISA)檢測藥物處理24 h后，收集上清培養液，按照試劑盒說明書，采用雙抗體夾心ELISA法檢測培養液中的TNF-α、IL-1β及半胱氨酰白三烯(CysLTs)含量。用酶標儀測定450 nm光密度值，根據標準曲線計算樣本中各因子的含量。

1.7統計學方法應用SPSS13.0行單因素方差分析和Dunnett檢驗。

2結果

2.11,8-桉油素對神經元細胞活性的影響Aβ25~35作用24 h后，神經元細胞存活率明顯下降，與對照組比較顯著差異(P<0.01)；1,8-桉油素(1 μmol/L和10 μmol/L)預處理后，與模型組比較，細胞存活率顯著增高(P< 0.01)。見表1。

2.21,8-桉油素對TNF-α和IL-1β釋放的影響與對照組比較，模型組TNF-α和IL-1β的含量明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，1,8-桉油素 10 μmol/L預處理后，顯著降低TNF-α和IL-1β的水平(P<0.01)，1,8-桉油素 1 μmol/L預處理明顯減少TNF-α和IL-1β的釋放，但統計學差異不明顯。見表2。

2.31,8-桉油素對神經元CysLTs水平的影響Aβ25~35處理后，神經元CysLTs釋放增加，與對照組比較，模型組CysLTs水平明顯上調(P< 0.01)；與模型組比較，1,8-桉油素10 μmol/L預處理顯著抑制CysLTs的釋放(P<0.01)，1,8-桉油素1 μmol/L預處理雖明顯降低CysLTs的水平，但無顯著差異。見表2。

表1　各組細胞活性測定±s)

與對照組比較：1)P<0.01； 與模型組比較：2)P<0.01；下表同

表2　上清液中TNF-α和IL-1β及CysLTs水平檢測

3討論

Aβ在神經元內的沉積及其神經毒性在AD的發生發展中起著關鍵作用，證據表明〔2〕，炎癥是導致疾病進展的極為重要的組成部分。本研究采用Aβ25~35，處理原代培養的皮層神經元24 h后能較好地建立AD細胞損傷模型。Aβ25~35處理后，細胞存活率明顯下降，可能與TNF-α、IL-1β釋放明顯增加有關。

神經炎癥是AD患者腦內的重要病理特征之一，而本研究發現1,8-桉油素能明顯抑制Aβ誘導的炎癥反應。研究表明〔6〕，在AD模型，幾乎所有的炎癥因子釋放都會出現明顯增加,TNF-α是一種在腦內能促進細胞存活和死亡很強的前炎癥因子， IL-1β作為一種免疫調節因子可誘導神經元多種炎癥因子的釋放。CysLTs(包括LTC4、LTD4、LTE4)是花生四烯酸經5-脂氧酶的代謝產物，能夠促進Aβ的生成〔7〕。在AD患者腦脊液或血漿中，TNF-α和IL-1β的水平顯著增高〔2〕；轉基因AD小鼠中下調TNF-α的表達，老年斑或tau蛋白的生成明顯減少〔8〕。本文采用1,8-桉油素預處理皮層神經元顯著減少Aβ誘導的炎癥因子釋放增加，表明其具有很強的抗感染作用。然而炎癥發生的機制尚不清楚，有研究發現Aβ能夠誘導NF-κB激活，而以前的研究表明1,8-桉油素能夠調節NF-κB的激活〔9,10〕，但是否參與Aβ的調節有待闡明。

4參考文獻

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〔2015-07-11修回〕

(編輯袁左鳴)

Effect of 1,8-cineol pretreatment on inflammatory response induced by Aβ25~35in primary cultured cortical neurons

WANG Lin，ZHAO Chun-Zhen.

Department of Pharmacology, Laboratory of Applied Pharmacology, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of 1,8-cineol against Aβ(25~35)-induced inflammatory response in rat primary cultured neurons.MethodsRat primary cultured cortical neurons were randomly divided into control, Aβ(25~35)(20 μmol/L), low dose of 1,8-cineol (Aβ(25~35) 20 μmol/L + 1,8-cineol 1 μmol/L)，high dose of 1,8-cineol(Aβ(25~35) 20 μmol/L +1,8-cineol 10 μmol/L) groups. Cell viability was evaluated by 3-(4,5-dimethyl -2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT) reduction assay. Neuron injury was induced 24 h after Aβ(25~35) treatment. Releases of TNF-α, IL-1β and CysLTs in the supernatant were determined by ELISA.Results20 μmol/L of Aβ(25~35) incubated for 24 h significantly reduced neuronal activity, and increased TNF-α, IL-1β and CysLTs releases. Pretreatment with 1,8-cineol obviously inhibited cytotoxicity and decreased the level of above cytokines and CysLTs releases.Conclusions1,8-cineol has a protective effect on Aβ(25~35) induced neuron injury, probably relates with inhibition of TNF-α, IL-1β and CysLTs releases.

【Key words】1,8-cineol; Alzheimer's disease; Inflammation; Cytokines

〔中圖分類號〕R749.1

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1540-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.002

通訊作者：趙春貞(1984-)，男，博士，副教授，主要從事神經藥理學研究。

基金項目：國家自然科學基金專項基金項目(81341137)；濰坊市科技局項目(201301071)