眼針對腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦皮層組織TLR4、MyD88表達的影響

趙丹玉　苗蘭英　曹　陽　王德山

(遼寧中醫藥大學基礎醫學院，遼寧　沈陽　110847)

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眼針對腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦皮層組織TLR4、MyD88表達的影響

趙丹玉苗蘭英曹陽王德山

(遼寧中醫藥大學基礎醫學院，遼寧沈陽110847)

〔摘要〕目的探討眼針治療腦缺血再灌注損傷(CIRI)模型大鼠腦皮層組織中Toll樣受體4(TLR4)及髓樣分化因子88(MyD88)的作用機制。方法健康雄性SPF級Wistar雄性大鼠60只，隨機分為正常組、假手術組、CIRI模型組和眼針組。CIRI模型組和眼針組采用改良的線栓法建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注(MACO)動物模型。酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測大鼠血清白細胞介素(IL)-1β水平，Western 印跡檢測大鼠缺血側腦皮層TLR4、MyD88蛋白表達的變化。結果與正常組及假手術組比較，模型組大鼠血清IL-1β水平明顯升高(P<0.01)，缺血側腦皮層組織TLR4、MyD88蛋白水平均顯示高表達(P<0.01)；眼針組同模型組相比，血清IL-1β水平顯著下降(P<0.01)，缺血側腦皮層組織TLR4、MyD88蛋白表達明顯下調(P<0.01)。結論眼針抑制腦皮層組織中TLR4、MyD88的表達，降低炎癥反應，可能是眼針治療CIRI的主要作用機制之一。

〔關鍵詞〕眼針；腦缺血再灌注；TLR4；MyD88

眼針療法是在眼眶周圍進行針刺防治疾病的一種微針療法，其理論基礎是眼通過經絡系統與臟腑密切相連。臨床上根據不同臟腑、器官的病變和病位選取相應的穴位進行針刺，從而達到治療全身不同部位疾病的目的。多年的臨床實踐證明，本療法對于急性腦缺血性疾病具有很好的療效，然而眼針治療腦缺血性疾病的作用機制尚亟待研究闡明。本課題建立大鼠腦缺血再灌注損傷(CIRI)模型，觀察眼針對大鼠血清白細胞介素(IL)-1β水平及損傷側腦皮質Toll樣受體4(TLR4)和髓樣分化因子88(MyD88)蛋白表達的影響，研究眼針對CIRI的作用機制,為“眼絡于腦”的中醫理論假說提供實驗依據。

1材料與方法

1.1材料健康雄性SPF級Wistar雄性大鼠60只，體重280~320 g。購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)2008-0016。IL-1β ELISA試劑盒、一抗GAPDH、TLR4及MyD88多克隆抗體、羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2動物分組與模型復制60只大鼠以隨機數字法分為正常組、假手術組、模型組和眼針組，剔除造模不成功以及死亡鼠，最終每組均為12只。

正常組：常規喂養無任何施加因素。模型復制與成模標準：采用改良的線栓法建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注(MACO)動物模型(右側栓塞)〔1〕。造模后參照Longa 5分制評分標準進行神經功能缺損評分〔2〕。神經功能缺損評分≥1分視為造模成功。將造模成功的大鼠再隨機分為模型組和眼針組。假手術組：術式與操作基本過程同模型組和眼針組，只是不進行大腦中動脈栓塞。模型組常規喂養，不給予任何刺激。眼針組在缺血再灌注即刻、造模術后12、24 h(即處死前)各進行眼針1次。

1.3眼針取穴與刺法參照人體取穴定位法分別取上焦區、下焦區、肝區、腎區；刺法：用35×25 mm毫針在相應眼穴區距眶內緣2 mm處，平刺，由該區始點向該區終點方向，刺入0.3 cm，行捻轉手法，留針30 min，15 min行針1次，時間1 min。

1.4血清IL-1β含量的測定各組大鼠CIRI術后24 h麻醉后腹主動脈取血，分離血清后按照武漢博士德生物工程公司IL-1β的ELISA試劑盒說明進行操作。

1.5Western 印跡檢測TLR4及MyD88蛋白表達于造模術后24 h每組各取6只鼠，麻醉后,迅速斷頭取腦，于無菌條件下冰上分離右側皮層組織，加入相應體積的裂解液后勻漿， 12 000 r/min離心30 min，收集上清，檢測各樣本蛋白濃度。將樣品和蛋白分子量標準分別加入膠孔內開始電泳。電泳完畢，半干式轉印槽印跡約1.5 h，封閉，37℃，2 h，加入適當稀釋的一抗(TLR4、MyD88、GAPDH均以1∶100用封閉液稀釋)，4℃過夜。TBST沖洗后加入1∶2 000稀釋的酶標二抗，37℃，45 min。DAB顯色。掃描硝酸纖維素膜上的條帶，凝膠掃描系統進行吸光度積分分析(IOD)，以GAPDH作為內參，各組TLR4、MyD88的蛋白表達強度IOD和內參GAPDH的蛋白表達強度IOD比值顯示各組TLR4、MyD88的蛋白表達。

2結果

2.1眼針對CIRI 模型大鼠一般狀態影響正常組及假手術組大鼠無神經功能缺損體征出現，根據神經功能缺損評分標準評分均為0分。模型組及眼針組大鼠術中死亡7只，另外有5只大鼠神經功能缺損不明顯，即將造模成功的大鼠隨機分為模型組和眼針組各12只。造模成功的大鼠蘇醒后出現明顯的不能完全伸展對側前爪、向對側轉圈及向對側傾倒等神經功能缺損癥狀。術后24 h,模型組動物神經功能缺損癥狀隨時間延長逐漸加重，神經功能缺損評分具有明顯的上升趨勢；眼針組神經功能缺損癥狀加重不明顯，顯示出眼針治療的腦保護作用。

2.2眼針對CIRI模型大鼠血清IL-1β含量的影響假手術組〔(44.04±4.47)μg/mg〕同正常組〔(45.30±4.10)μg/mg〕比較，血清中IL-1β含量沒有明顯差異(P>0.05)。模型組血清中IL-1β含量〔(83.94±5.15)μg/mg〕顯著升高(P<0.01)；眼針組血清中IL-1β含量〔(61.13±3.43)μg/mg〕明顯下降(P<0.01)。

2.3眼針對CIRI模型大鼠大腦皮層組織TLR4、MyD88蛋白表達影響如圖1、表1所示，正常組及假手術組大鼠右側大腦皮層組織TLR4、MyD88蛋白均表達較少，二者之間沒有顯著差異(P>0.05)；與正常組與假手術組相比較，CIRI模型組TLR4、MyD88均呈現明顯高表達(P<0.01)；而眼針組表達較模型組明顯下降(P<0.05)。

圖1　TLR4、MyD88蛋白印跡

表1　各組TLR4、MyD88蛋白表達水平比較

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

3討論

TLR4是Toll樣受體(TLR)家族的成員之一，屬于I型跨膜受體蛋白。其胞外區負責識別病原菌或內源性配體；胞內區具有TIR結構域，主要作用是介導細胞應答的信號啟動，參與炎癥反應或炎癥病理反應。MyD88屬于TLR家族和死亡結構域家族成員，其羧基端具有TIR結構域，可以同TLR4的TIR結構域結合；氨基端具有死亡結構域(DD)，可以募集細胞內的IL-1受體相關激酶(IRAK)并使其磷酸化。TLR4作為膜結合蛋白，當與配體結合后，其胞內的TIR結構域連接胞內銜接蛋白MyD88，進而啟動下游IRAK磷酸化，繼而激活腫瘤壞死因子(TNF)受體相關因子(TRAF)〔3~6〕，激活核因子(NF)-κB，促進多種細胞因子及炎癥因子的表達，啟動炎癥反應〔7，8〕。此為MyD88依賴的TLR4信號轉導通路。

CIRI的病理生理是一個多環節、多因素、多途徑損傷的級聯反應過程〔9〕，其發病機制目前也沒有完全研究清楚，但是已證實，腦缺血再灌注時的炎癥反應促進了繼發性腦損害,是CIRI的主要原因之一〔10〕。已有大量的研究表明，TLR4與CIRI密切相關〔11，12〕。本課題的前期研究以及對于血清IL-1水平的檢測均證明了CIRI時炎癥反應明顯加強。模型組大鼠缺血側大腦皮層組織TLR4蛋白表達明顯增高〔13〕，同以往的研究結果一致。結合本實驗對于模型組大鼠缺血側大腦皮層組織MyD88蛋白表達的檢測結果，CIRI時有可能由于某些內源性炎癥介質的釋放促進了TLR4的表達，極有可能激活了TLR4介導的MyD88依賴的信號轉導通路，從而使NF-κB活化，啟動TNF-α、IL-1β等炎癥因子的轉錄，加重了CIRI時炎癥反應。而眼針組大鼠缺血側大腦皮層組織TLR4及MyD88的蛋白表達均顯著降低。說明眼針刺激能夠抑制TLR4及MyD88的表達，進而抑制其下游蛋白的活化，抑制NF-κB與炎癥因子的結構基因上游的調控序列結合，抑制炎癥因子的表達而減輕其炎癥反應，從而達到對腦皮層組織的保護目的，這可能是眼針對于CIRI有顯著療效的機制之一。至于MyD88表達的下調是TLR4表達下調后的結果還是眼針刺激的調節靶點，還有待于今后作進一步的研究。

4參考文獻

1馬賢德，孫宏偉,柴紀嚴，等.線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的方法研究〔J〕.中華中醫藥學刊，2009；27(6):1200-1.

2Longa EZ,Weinstein PR,Carison S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without carniectomy in rats.〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

3Kishore SP,Bungum MK,Platta JL,etal.Selective suppression of Toll-like receptor 4 activation by chemokine receptor 4〔J〕.FEBS Lett,2005;579(3):699-704.

4Janssens S,Beyaert R.A universal role for MyD88 in TLR/IL-1R-mediated signaling〔J〕.Trends Biochem Sci,2002;27(12):474-83.

5McGettrick AF,O'Neill LA.The expanding family of MyD88-like adaptors in Toll-like receptor signal transduction〔J〕.Mol Immunol,2004;41(6-7):577-82.

6Suzuki N,SaitoT.IRAK-4-a shared NF-κB activator in innate and acquired immunity〔J〕.Trends Immunol,2006;27(6):566-73.

7Velayudham A,Hritz I,Dolganiuc A,etal.Critical role of Toll-like receptors and the common TLR adaptor,MyD88,in induction of granulomas and liver injury〔J〕.J Hepatol,2006;45(6):813-24.

8Yang YX,Zhou HD,Yang YB,etal.Lipipolysaccharide(LPS)regulates TLR4 signal transduction in nasopharynx epithelial cell line 5-8F via NF-κB and MAPKs signaling Pathways〔J〕.Mol Immunol,2007;44(5):984-92.

9陶錄嶺，劉軻.中藥單體對腦缺血再灌注損傷保護的實驗研究進展〔J〕.時珍國醫國藥，2012；23(12):3107-9.

10孔立紅，劉勝洪，毛娟娟，等.電針對腦缺血大鼠 NF-κB 及 TNF-α表達的影響〔J〕.中國康復醫學雜志，2009；24(8):711-4.

11高音，王玉，張翠香，等.TLR4與TNF-α在腦缺血再灌注小鼠海馬CA1區神經元中的表達〔J〕.神經解剖學雜志，2010；26(2):175-80.

12Caso JR,Pradillo JM,Hurtado O,etal.l Toll-like receptor4 is involved in brain damage and inflammation after experimental stroke〔J〕.Circulation,2007;115(12):1599-608.

13趙丹玉，王哲，馬賢德，等.眼針對腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦皮層組織TLR4表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(15):2895-7.

〔2013-07-30修回〕

(編輯曲莉)

Influences of eye acupuncture on the expression of IKKβ/NF-κB in rat's brain after acute cerebral ischemia/reperfusion

ZHAO Dan-Yu,MIAO Lan-Ying,CAO Yang,etal.

College of Basic Medical,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,Liaoning,China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the expressions of TLR4 and MyD88 in cerebral ischemia-reperfusion injury(CIRI) in rat brain cortex and the effect of eye acupuncture.MethodsAdult male SPF Wistar male rats were randomly divided into normal,sham operation,CIRI model and eye acupuncture groups.The model of middle cerebral artery occlusion(MACO) was established by the improved suture method.ELISA method was performed to determine the IL-1β level,Western blot was performed to examine the protein expressions of TLR4 and MyD88 in the ischemic brain cortex.ResultsThe IL-1β level and protein expressions of TLR4 and MyD88 in CIRI model group were increased significantly ( P< 0.01) compared with those in normal and sham operation groups,and which were decreased significantly (P<0.01) in eye acupuncture group.ConclusionsEye acupuncture therapy could reduce the IL-1β level and expressions of TLR4 and MyD88 in CIRI ,which might be the treatment mechanism of eye acupuncture therapy on CIRI rat .

【Key words】Eye acupuncture; Cerebral ischemia and reperfusion;TLR4;MyD88

〔中圖分類號〕R28516

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1547-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.005

通訊作者：王德山(1951-)，男，教授，博士生導師，主要從事中醫藥對消化道神經內分泌影響機制的研究。

基金項目：國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(No.2007CB512700)；遼寧省教育廳課題(No.L2010349)

第一作者：趙丹玉(1978-)，女，博士，副教授，主要從事中醫藥對受體及受體后信號轉導途徑影響機制的研究。