不同時間電針對血管性癡呆小鼠學習記憶能力與海馬氧自由基的影響

孫彥輝　梁玉磊　張　闖　邢海嬌　張　茜　張佳音　張會珍　馬小順

(河北中醫學院，河北　石家莊　050200)

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不同時間電針對血管性癡呆小鼠學習記憶能力與海馬氧自由基的影響

孫彥輝梁玉磊張闖邢海嬌張茜1張佳音1張會珍馬小順

(河北中醫學院，河北石家莊050200)

〔摘要〕目的通過觀察不同時間電針對血管性癡呆(VD)模型小鼠行為學與海馬超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)的含量變化，探討電針干預對VD的治療效應及可能的作用機制。方法采用頸總動脈結扎缺血再灌注的方法復制VD模型，將小鼠隨機分為兩批，第1批于造模當日給予電針干預，第2批于造模第3天給予電針干預，并設假手術組、模型組進行對照。電針組選取雙側“足三里”、“膈俞”及“百會”、“大椎”，針刺得氣后接通電針儀，采用疏密波，頻率2/80 Hz，每次治療10 min，連續15 d，觀察比較各組小鼠行為學與海馬SOD活性及MDA、NOS含量的變化。結果與假手術組比較，各模型組學習和記憶成績均顯著下降(P<0.01)，海馬SOD活性均明顯降低(P<0.01)，MDA、NOS含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，各電針組學習和記憶成績均顯著提高(P<0.01)，海馬SOD活性均明顯升高(P<0.01)，MDA、NOS含量均顯著降低(P<0.01)，并且造模第3天治療效果優于造模當日(P<0.05或 P<0.01)。結論電針能夠提高VD小鼠的學習記憶能力，其作用機制與對抗腦缺血損傷后氧化損傷有關，并初步發現介入干預時間不同，其治療效應存在差異。

〔關鍵詞〕血管性癡呆；超氧化物歧化酶(SOD)；丙二醛(MDA)；一氧化氮合酶(NOS)；電針

血管性癡呆(VD)是由腦血管疾病所致的智能及認知障礙臨床綜合征，與腦血管疾病聯系密切〔1〕，其中以認知功能障礙為核心表現〔2〕，嚴重影響患者生存質量。目前，隨著腦血管病發病的逐年升高，VD的防治已成為亟待解決的問題〔3〕。研究表明，針刺治療本病安全，不僅可以有效改善認知功能，還能夠改善整體功能〔4,5〕。但對具有臨床指導意義的效應規律研究尚存不足，尤其是腦缺血后有關針刺介入時間與干預效應方面的研究。本研究通過對缺血再灌注VD模型小鼠進行電針干預，并于造模當日和造模第3天作為介入時間點，觀察并比較其對VD小鼠學習記憶能力及海馬超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)含量的影響，初步探討電針治療本病的作用機制和針灸介入治療較理想的干預時機，以期為臨床尋求理想治療方法和治療時機提供實驗依據。

1材料與方法

1.1動物與分組選用健康雄性昆明小鼠60只，體質量28~32 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供(昆明小鼠二級實驗動物，合格證號：612159)。將其隨機分為兩批，每批各設假手術組、模型組、電針組，每組10只。恒溫單籠飼養，自然進食水。實驗動物的處理方法均經河北醫科大學實驗動物管理委員會審核批準。

1.2試劑與儀器試劑：MDA、SOD、NOS試劑盒(南京建成生物工程研究所)；總蛋白測定試劑盒(保定長城試劑有限公司)。儀器：華佗牌針灸針(蘇州醫療用品廠)、韓氏電針儀WQ1002F型(北京華衛產業開發公司)、小鼠跳臺儀(中國醫學科學院藥物研究所)、MSE-25型高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)；TDL-5-A型離心機(上海安亭科學儀器廠)；HH-W21-600型電熱恒溫水箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；FA2004型上皿電子天平(上海精科天平儀器廠)；722型光柵分光光度計(上海第三分析儀器廠)；GL-88B型旋渦混勻器(江蘇海門其林醫用儀器廠)。

1.3模型復制造模方法參照文獻〔6〕。將小鼠用10%水合氯醛0.35 g/kg經腹腔注射麻醉，頸部正中常規消毒后切口，分離出雙側頸總動脈，套“4”號絲線扣并拉緊，阻斷血流20 min，同時在距離尾尖1 cm處剪斷放血約0.3 ml，熱凝止血。松開絲扣，使血液灌注10 min，再次阻斷血流20 min。第2次再灌后觀察30 min，縫合皮膚。假手術組分離出頸總動脈，穿線但不結扎，尾部也不放血，觀察時間與其他組相同。術后每日肌注青霉素0.2萬U，連續3 d。術中維持小鼠肛溫(36±0.5)℃，防止低溫對缺血所致腦損傷的保護作用。

1.4針刺方法第1批小鼠于造模當天蘇醒后開始電針干預；第2批小鼠于造模第3天開始電針干預。電針組：將小鼠固定于自制束鼠器上，參照《中國獸醫針灸學》〔7〕，選取“百會”、“大椎”、“足三里”(雙側)、“膈俞”(雙側)，選用0.35 mm×13 mm毫針，常規消毒，針刺得氣后，接韓氏電針儀，采用疏密波，頻率2/80 Hz，強度以小鼠肢體輕微顫動，但不掙扎嘶叫為度(約2.0 mA)，每次治療10 min，1次/d，連續15 d。模型組和假手術組：將小鼠固定于自制束鼠器上10 min，但不施加電針干預，1次/d，連續15 d。

1.5觀察指標及檢測方法

1.5.1行為學檢測治療結束后采用跳臺實驗進行行為學測試。先將小鼠置于跳臺儀中，適應環境3 min，然后底部銅柵通以36 V交流電，記錄小鼠受到電刺激后跳上橡皮墊的反應時間和5 min內受電擊次數(錯誤次數)，作為學習成績。24 h后將小鼠置于跳臺儀中適應3 min，再將其置于橡皮墊上，記錄第一次跳下橡皮墊所需時間(潛伏期)和5 min內受電擊次數(錯誤次數)，作為記憶成績。

1.5.2海馬SOD活性及MDA、NOS含量測定跳臺實驗結束后麻醉下斷頭處死小鼠，根據小鼠腦立體定位圖〔8〕，冰盤上快速剖取全腦，棄去嗅球及小腦。取小鼠右側海馬組織稱重后加入預冷的生理鹽水，用電動勻漿器研磨，鏡檢未見完整細胞，制成10%組織勻漿，4℃，3 600 r/min，離心5 min后提取上清液備用。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，硫代巴比妥酸(TBA)比色分析法測定MDA含量，分光光度法測定NOS含量(所有實驗指標由河北醫科大學中醫學院實驗中心檢測)。

2結果

2.1各組小鼠行為學檢測兩批模型組小鼠的反應時間均延長，潛伏期均縮短，錯誤次數均增加(P<0.01)，表明造模成功；兩批電針組小鼠反應時間均縮短，潛伏期均延長，錯誤次數均明顯降低，與同批模型組比較有顯著差異(P<0.01)；且兩批電針組之間比較有差異，造模第3天電針組記憶成績優于造模當天組(P<0.05或P<0.01)。見表1,表2。

表1　各組小鼠跳臺學習成績比較

與假手術組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

表2　各組小鼠跳臺記憶成績比較

與假手術比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01；與第1批比較:3)P<0.05，4)P<0.01

2.2各組小鼠海馬SOD活性及MDA、NOS含量測定與假手術組比較，各批模型組小鼠海馬SOD活性均明顯下降，MDA和NOS含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，各批電針組海馬SOD活性均明顯增高，MDA和NOS含量均顯著降低(P<0.01)，且兩批電針組之間比較有差異，造模第3天電針組改善優于造模當天組(P<0.05)。見表3。

表3　各組小鼠海馬SOD活性及MDA、NOS含量比較

與假手術組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01；與第1批比較:3)P<0.05

3討論

研究證實，腦缺血再灌注可觸發腦組織中自由基的大量產生，過剩的自由基可使腦組織受損〔9〕，其可直接作用于生物膜磷脂引發脂質過氧化作用，導致膜功能障礙和膜酶損傷，進而影響腦內神經遞質的釋放和攝取。同時，脂質過氧化過程中生成的自由基又會對酶和細胞成分造成損傷，甚至導致細胞的死亡〔10〕，引發智能與認知障礙。MDA是脂質過氧化物的分解產物，能夠交聯蛋白質與核酸，使DNA發生突變，導致蛋白質合成能力下降或合成功能紊亂，同時，還可使自由基清除劑的關鍵酶SOD生成減少、活性降低。SOD可以延緩或防止生物物質氧化，減輕自由基造成的損傷。其通過催化生物氧化產生超氧自由基，清除并阻止氧離子引發的自由基連鎖反應，從而起到保護腦細胞的作用〔11〕。

一氧化氮(NO)是不配對電子自由基〔12〕，在體內具有雙重作用，適量的NO可清除自由基，調節腦血流量，加強學習記憶功能〔13〕；但NO相對過多時，則會與氧自由基相互作用生成毒性更強的過氧亞硝酸自由基(OONO-)，進而影響腦功能的恢復〔14〕。NOS是NO產生的關鍵酶，其通過Ca2+通道而被激活，其作用于機體可合成大量NO，因此，NOS的表達水平，可直接反映細胞內NO水平〔15〕。

研究證實，全腦缺血再灌注后6 h海馬區單胺類神經遞質含量上升，但于1 d開始回落，3 d已明顯低于對照組，5 d又回升并接近對照組〔16〕。病理觀察證實，重復缺血再灌注早期，神經細胞間質水腫、變性，海馬區無明顯改變；而再灌注3 d，海馬神經凋亡百分率最高，此后隨再灌注時間延長，海馬神經細胞凋亡數逐漸下降〔17〕，而缺血再灌注后5 d神經元明顯死亡，表現出典型的遲發性神經元死亡現象〔18,19〕。

以上研究表明，缺血再灌注3 d，海馬區單胺類神經遞質降低最為明顯，海馬神經凋亡百分率最高，是機體處于相對明顯且可逆轉的缺血損傷狀態，筆者認為，此時給予電針干預，可充分發揮針灸所具有的雙向良性調整作用；缺血當天，機體內環境處于相對紊亂狀態，病理改變尚不明顯，針灸的雙向作用難以充分發揮；缺血再灌注5 d以后，海馬神經元明顯死亡，逆轉概率也會降低。故本研究設造模當日和造模后3 d作為電針干預時間點，結果顯示，造模后3 d電針干預組療效優于造模后當日電針干預組。

VD屬于中醫“老年呆病”范疇。《本草綱目》曰“腦為元神之府”，《本草備要》也有“人之記性，皆在腦中”，故祖國醫學認為，癡呆的病位在腦。《靈樞·調經論》記載：“血并于上，氣并于下，亂而善忘。”《雜病源流犀燭·中風》指出“有中風后善忘”，故筆者認為，VD的發生多與氣虛血瘀、瘀阻腦絡，以致腦髓失養，神明失常密切相關。督脈入屬于腦，百會、大椎可疏通督脈經氣，使腦部氣血通暢，恢復元神之府之所主，《針灸大成》載：“百會主心煩悶，驚悸健忘，忘前失后，心神恍惚。”有研究表明，百會有明顯提高記憶力的作用〔20〕。膈俞乃血之會穴，有養血活血，祛瘀活絡之功；足三里健運脾胃，既扶助正氣以推動血行，又益氣生血以充養腦髓。四穴合用，益氣活血，醒腦益智，從而使“血脈和利，精神乃居”。本實驗結果表明電針能夠提高模型小鼠的學習記憶能力，改善缺血再灌注所致的認知障礙，其作用機制可能與電針清除機體自由基，提高機體的抗氧化能力，保護受損的海馬組織有關，且可能存在一定的時效關系。

4參考文獻

1王佳，楊俊卿，余麗娟，等.血管性癡呆大鼠海馬神經元核因子-κB與環氧合酶-2水平的動態變化〔J〕.中國老年學雜志，2014；34(2)：409-12.

2Benisty S.Current concepts in vascular dementia〔J〕.Geriatr Psychol Neuropsychiatr Vieil，2013；11(2)：171-80.

3張楠.血管性癡呆的治療進展〔J〕.中國全科醫學，2012；16 (12C)：4239-41.

4高康，李飛，張慶萍，等.電針對血管性癡呆大鼠血清"腦組織中乙酰膽堿酯酶活性及學習記憶能力的影響〔J〕.遼寧中醫雜志，2013；40(11)：2367-8.

5張會珍，張麗欣，佘延芬，等.電針對擬血管性癡呆小鼠腦組織海馬細胞凋亡的影響〔J〕.針刺研究，2008;33(6)：377-81.

6張會珍，梁玉磊，張雪靜，等.不同時間電針對血管性癡呆小鼠行為學及海馬單胺類神經遞質的影響〔J〕.針刺研究，2014;39(2)：142-7.

7中國獸醫針灸學會.中國獸醫針灸學〔M〕.北京：北京農業大學出版社，1984：212.

8包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜〔M〕.北京：人民衛生出版社，1991：17-83.

9尹麗，趙鳳琴，張福華，等.醒腦益智方對血管性癡呆大鼠氧自由基和腫瘤壞死因子的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(1)：90-2.

10Javadzadeh A，Ghorbanihaghjo A，Bonyadi S，etal.Preventive effect of onion juice on selenite-induced experimental cataract〔J〕.Indian J Ophthalmol，2009;57：185-9.

11李志勇，趙暉，張琪.兩種血管性癡呆模型大鼠學習記憶能力與海馬自由基代謝的比較〔J〕.中國老年學雜志，2012;32(22)：4940-2.

12鐘慈聲，孫安陽.一氧化氮生物醫學〔M〕.上海：上海醫科大學出版社，1997：150.

13Vincent SR,Kimura H. Stochenmical mapping of nitric oxide synthase in the rat brain〔J〕.Neuroscience，1992;46：755-8.

14井沆，肖雁，官志忠.血管性癡呆模型大鼠NOS、NO的表達〔J〕.中風與神經疾病雜志，2013;30(10)：902-5.

15Min D，Guo F，Zhu S，etal.The alterations of Ca2+/calmodulin/CaMKⅡ/CaV1.2 signaling in experimental models of Alzheimer's disease and vascular dementia〔J〕.Neurosci Lett，2013;22(538)：60-5.

16李兵，章翔，蔣曉帆，等.全腦缺血后海馬區單胺類神經遞質的變化〔J〕.中華神經外科疾病研究雜志，2006；5(3):244-7.

17李巍，姜立剛，徐忠信，等.實驗性血管性癡呆小鼠中樞神經系統細胞凋亡與遲發性神經元壞死〔J〕.中國臨床康復，2005；9(28)：133-5.

18李梨，郭建增，周歧新，等.腦缺血再灌注致小鼠學習記憶障礙模型的建立〔J〕.重慶醫科大學學報，2005；30(3)：412-5.

19胡志云，王洪津，姜長斌，等.腦缺血再灌注后海馬谷氨酸和神經生長因子的表達〔J〕.大連醫科大學學報，2005；27(3)：170-3.

20韋登明，賈學敏，尹向旭，等.電針改善血管性癡呆大鼠學習記憶及其與海馬神經細胞蛋白激酶C表達的關系〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(2)：328-30.

〔2014-09-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

〔中圖分類號〕R245.9

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1549-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.006

通訊作者：張會珍 (1962-)，女，碩士生導師，教授，主要從事針灸防治心腦血管病研究。

基金項目：河北省自然科學基金資助項目(No.H2013206245)；河北省中醫藥管理局計劃項目(No. 2004010)；河北省中醫藥管理局計劃項目(No. 05155)

1河北醫科大學研究生

馬小順(1971-)，男，副教授，主要從事經穴特異性研究。

第一作者：孫彥輝(1971-)，男，博士，副教授，主要從事針灸臨床與作用機制的研究。