二苯乙烯苷對APP/PS1雙轉基因小鼠APP、PS1基因表達的影響

楊曉穎　劉　寧　黃岑漢　劉燕平　黃忠仕

(廣西中醫藥大學，廣西　南寧　530000)

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二苯乙烯苷對APP/PS1雙轉基因小鼠APP、PS1基因表達的影響

楊曉穎劉寧1黃岑漢1劉燕平黃忠仕1

(廣西中醫藥大學，廣西南寧530000)

〔摘要〕目的探討何首烏提取物二苯乙烯苷(TSG)對APP/PS1雙轉基因小鼠腦組織中β淀粉樣前體蛋白(APP)和早老素-1(PS1)基因的表達變化。方法3月齡APP/PS1雙轉基因小鼠50只，隨機分為APP/PS1對照組、石杉堿甲組和TSG高、中、低(0.3、0.1、0.033 g/kg )劑量組，另取同齡C5B7L/6J小鼠10只為正常對照組。分別給予相應藥物60 d后，應用FQ-PCR法檢測腦組織中APP、PS1 mRNA的表達。結果與APP/PS1對照組比較，TSG高、中、低各劑量組以及石杉堿甲組APP、PS1mRNA表達均明顯下調(P<0.01或P<0.05)；TSG各劑量組與石杉堿甲組比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論二苯乙烯苷可對阿爾茨海默病起到一定防治保護作用，其機制可能與APP、PS1基因受到明顯抑制有關。

〔關鍵詞〕二苯乙烯苷；阿爾茨海默病；β淀粉樣前體蛋白；早老素-1

阿爾茨海默病(AD)是一種進行性的不可逆的神經退行性疾病，現已成為嚴重威脅老年人健康的四大疾病之一〔1〕。二苯乙烯苷(2,3,5,4，-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，TSG)是中藥何首烏的主要水溶性成分，具有抗衰老、神經保護、降血脂及抗動脈硬化等作用〔2,3〕。本實驗重在探討TSG對APP/PS1雙轉基因小鼠腦保護作用的可能機制，為TSG的臨床應用和新藥的研究開發提供實驗依據。

1材料與方法

1.1動物APP/PS1雙轉基因鼠和C5B7L/6J，雄性，體重26~30 g，SPF級，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供(動物質量許可證號 SCXK(京)2014-0004)。

1.2藥物及試劑TSG(成都克洛瑪生物科技有限公司，批號 14112)，石杉堿甲(河南太龍藥業股份有限公司，批號：H10940156)，總RNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Uniwersal RNA Extaraction Kzit,code No.9767),逆轉錄試劑盒(TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit With gDNA Eraser Perfect Real Time,Code No,RR047A),實時熒光定量試劑盒(TaKaRa SYBR×R Premix Ex TaqTMⅡ TLi R Nase H Plus,Code,No,RR820A),均購自大連寶生物有限公司。

1.3儀器超低溫冰箱(日本SANYO公司，型號：MDF-u72v)，制冰機(日本SANYO公司，型號：SIM-F124)，漩渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司，型號：XW-80A)，高速冷凍離心機(美國 Sigma 公司，型號：1-14K)，超微量分光光度計(德國IMPLEN公司，型號：Nanophtoometer Pearl360)，全自動凝膠成像系統(培清科技，型號：JS-680B)，電泳儀(北京六一儀器廠，型號：DYY-6D)，普通梯度PCR儀(美國BIO-RAO公司，型號：PTC-200)，Real Time PCR儀(美國BIO-RAO公司，型號：IQ5)。

1.4動物分組與給藥3月齡APP/PS1雙轉基因雄性小鼠50只，隨機分為APP/PS1對照組、石杉堿甲(陽性藥對照)組和TSG高、中、低劑量(0.3、0.1、0.033 g/kg)組，每組10只。另外，選擇3月齡C5B7L/6J雄性小鼠10只，作為正常對照組。APP/PS1對照組、正常對照組：予生理鹽水30 ml/kg，以上各組每日灌胃給藥l次，連續60 d。

1.5檢測指標及方法灌胃給藥第60天后，處死小鼠，取腦裝于凍存管中迅速置于-80℃冰箱保存。取小鼠腦組織含海馬區，液氮研磨后提取總RNA，紫外分光光度分析及瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA濃度、純度、完整性。根據cDNA逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。引物由大連寶生物有限公司設計合成,序列如表1。

表1　PCR反應引物

冰上配置反應體系：SYBR× R Premix Ex TaqTM(2×)10 μl，上下游引物各0.8 μl，cDNA模板2 μl，加dH2O至總反應體系為20 μl。反應條件(二步法擴增條件)：第1步：預變性，95℃ 30 s,1個循環。第2步:95℃，5 s,61℃，30 s，共40個循環。55℃，30 s，共81個循環。以GAPDH為內參通過2-△△CT法表示目的基因mRNA的相對表達水平。△CTintervention= CTinterventionAPP-CTinterventionGAPDH，△CTblank=CTblankAPP-CTblankGAPDH，△△CT=△CTintervention-△CTblank。APP mRNA 表達差別倍數以2-△△CT法表示。PS1 mRNA計算同前。PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.6統計學處理采用SPSS17.0軟件，多組計量資料采用ANOVA檢驗，多樣本均數的兩兩比較采用SNK檢驗。

2結果

A：APP/PS1對照組；B：正常對照組；C:石杉堿甲組；D：TSG高劑量組；E:TSG中劑量組；F:TSG低劑量組；M：marker圖1　2%凝膠電泳圖分析APP(A)與PS1(B)PCR擴增產物

2.1PCR 產物鑒定根據本實驗設計，引物APP、PS1、GAPDH擴增產物長度分別為193、129、90 bp。產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下掃描分析，在相應片段處均出現清晰的條帶并與設計相符，未見其他擴增產物(見圖1)。溶解曲線呈單一峰，說明產物特異性強，無非特異性擴增和引物二聚體產生。2.2對APP/PS1轉基因小鼠腦組織 APP mRNA表達的影響APP/PS1對照組與正常對照組比較有顯著差異(P<0.01)。TSG高、中、低劑量各組和石杉堿甲組APP、PS1 mRNA相對表達量均低于APP/PS1對照組(P<0.05，P<0.01)。表明給予TSG后可使PS1 mRNA下調。TSG各劑量組與石杉堿甲組比較無明顯統計學意義。見表1。

表1　TSG對各組小鼠APP、PS1 mRNA表達的影響

與APP/PS1對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

3討論

在眾多與AD相關的基因中，APP是第一個被發現的。APP基因位于第21號染色體，由19個外顯子構成，AD患者大腦中大量沉積的Aβ就是由APP基因的第16、17號外顯子所編碼〔4〕。Aβ是構成老年斑的核心成分，由APP水解產生。APP的異常代謝及Aβ的過度產生是AD發病的重要病理機制〔5〕。APP有兩條代謝途徑，在APP基因突變、炎癥等病理情況下，Aβ經β-分泌酶和γ-分泌酶剪切產生〔6〕。γ-分泌酶為一種天冬氨酸水解酶，是兩條途徑都需要的重要水解酶，PS1是γ-分泌酶的催化組分〔7~9〕。研究表明：缺失PS1的細胞分泌Aβ的能力會大大降低〔10〕。因此PS1也成為研究AD的重要靶點之一。AD動物模型良多，相較其他動物模型APP/PS1轉基因小鼠腦內不僅出現Aβ沉積、形成Aβ斑塊時間早，而且Aβ的量多，并伴有神經細胞損傷和突觸丟失以及與年齡有關的神經行為功能障礙等，因而是重要的模型之一〔11〕。TSG是傳統中藥何首烏的有效水溶性成分。近期研究表明TSG具有重要的腦保護作用〔12〕，且能抑制APP、PS1基因的產生，對AD有顯著的防治作用〔13〕。TSG還具有抗氧化，抗炎，抗動脈粥樣硬化等作用。

本次實驗結果表明，TSG可使APP/PS1轉基因小鼠腦組織中APP和PS1基因表達均受到明顯抑制，說明TSG對AD具有一定的治療保護作用，但作用機制還有待深入研究。

4參考文獻

1龍志敏，趙蕾，高寶兵，等.丙戊酸鈉對APP/PS1雙重轉基因AD模型小鼠腦內老年斑和神經元的影響〔J〕.中國神經精神疾病雜志,2011;37(8):477-81.

2王春英，何首烏中有效成分二苯乙烯苷的研究進展〔J〕.河北醫科大學學報,2008；29(1):157-60.

3賈新，陳建宗.二苯乙烯苷神經保護作用及其機制的研究進展〔J〕.國際中醫中藥雜志,2007；29(6):347-8.

4張婧.早發性癡呆相關基因的研究〔J〕.實用醫學雜志，2008；24(21)：3781-3.

5Zhang YW,Xu H.Molecular and cellular mechanisms for Alzheimer's disease:understanding APP metabolism〔J〕.Curr Mol Med,2007；7(7):687-96.

6Wolfe MS,Kopan R.Intramembrane proteolysis:theme and variations〔J〕.Science,2004；305(5)；1119-23.

7Bart De.Loss-of-function presenilin mutations in Alzheimer's disease〔J〕.EMBO Reports,2007;8(2):141-6.

8Pimplikar SW,Nixon RA,Robakis NK,etal.Amyloid-independent mechanisms in Alzheimer's disease pathogenesis〔J〕.J Neurosci,2010;30:14946-54.

9Chuang JY,Lee CW,Shih YH,etal.Interactions between amyloid-β and hemoglobin:implications for amyloid plaque formation in Alzheimer's disease〔J〕.PLoS One，2012;7(3):33120.

10Seshadri S,Fitzpatrick AL,Ikram MA,etal.Genome-wide analysis of genetic loci associated with Alzheimer disease〔J〕.JAMA,2010;303:1832-40.

11徐杰，周文聰，張媛英.何首烏活性成分二苯乙烯苷的研究進展〔J〕.泰山醫學院學報，2008；29(1):23-6.

12劉玲，朱曉瑩，賴術，等.二苯乙烯苷對SAMP8小鼠APP mRNA和PS1mRNA表達的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2013；19(1):240-3.

13Kemppainen S,Hamalainena E,Miettinen PO,etal.Behavioral and neuropathological consequences of transient global ischemia in APP/PS1 Alzheimer model 〔J〕.Behav Brain Res,2014；275(12):15-26.

〔2015-01-30修回〕

(編輯曲莉)

Effect of TSG on gene expression of APP and PS1 in APP/PS1 double transgenic mice

YANG Xiao-Ying,LIU Ning,HUANG Cen-Han,etal.

Guangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanning 530000,Guangxi,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of TSG which extraction from Polygonum multiflorum Thunb on gene expression of β-amyloid precursor protein(APP) and presenilin-1(PS1) in APP/PS1 double transgenic mice brain tissues.MethodsFifty three-months-old APP/PS1 double transgenic mice were randomly divided into five different groups：APP/PS1 control,huperzine A,high-,mid- and low-dose of TSG(0.3,0.1,0.033 g/kg) groups,with 10 mice in each group.Another 10 same age C5B7L/6J mice were assigned into normal control group.After medication corresponding drugs for 60 days,expressions of APP and PS1 mRNA in brain tissue were assayed by fluorescent quantitative-PCR.ResultsCompared with APP/PS1 control group,the expressions of APP and PS1 mRNA in all dose of TSG group and huperzine A group were down-regulated,the differences had statistical significances(P<0.01 or P<0.05);Compared with huperzine A group,all dose of TSG had no significant difference(P>0.05).ConclusionsTSG has certain preventive and therapeutic effect on Alzheimer's disease,which may be related to the inhibition of the expressions of APP and PS1 mRNA.

【Key words】2,3,5,4'-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside(TSG);Alzheimer's disease;β-amyloid precursor protein(APP);Presenilin-1(PS1)

〔中圖分類號〕R749

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1573-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.016

通訊作者：黃忠仕(1970-)，男，醫學博士，教授，主要從事抗癡呆藥物研究。

基金項目：國家自然科學基金項目(81260495)；廣西自然科學基金項目(2013GXNSFAA019212)

1右江民族醫學院

第一作者：楊曉穎(1990-)，女，在讀碩士，主要從事中醫診法與辨證的客觀化規范化研究。