成年大鼠心室肌細胞的急性分離方法

施光正　馬麗娟　趙海軍

(浙江醫學高等?？茖W校，浙江　杭州　310053)

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成年大鼠心室肌細胞的急性分離方法

施光正馬麗娟趙海軍1

(浙江醫學高等?？茖W校，浙江杭州310053)

〔摘要〕目的介紹一種新型的成年大鼠心肌細胞的急性分離方法。方法麻醉大鼠后快速取心臟，為心臟先循環灌流無鈣臺氏液，后循環灌流酶液，酶解完成后取左心室，迅速置于含0.5 mg/ml BSA的KB液(恒溫37℃)中拉碎，吹打數次后離心，去上清，溫育在含0.5 mg/ml BSA的KB溶液中35 min，梯度復鈣。結果首次分離細胞存活率在80%~90%，復鈣完成仍有40%~50%的細胞維持桿狀，橫紋清晰且90%以上細胞處于靜止狀態。結論通過該方法可獲得穩定、高比例的存活心肌細胞，能夠為成年大鼠心肌細胞原代培養及電生理學研究提供高品質細胞。

〔關鍵詞〕心肌細胞； 急性分離； Langendorff灌流

能夠得到高活性的心肌細胞是心肌細胞培養和電生理研究的基礎，隨著酶解法的不斷完善與創新，酶解法成為獲取成年大鼠心肌細胞的主要方式，但迄今為止尚未有完全統一的分離方法，本文主要闡述筆者的實驗方法。

1材料及方法

1.1材料Wistar雄性大鼠20只，220~250 g，由上海斯特萊動物責任有限公司提供(動物許可證號SCXK〔滬〕2012-0002)。

1.2主要試劑Ⅱ型膠原酶(C6885)、XⅣ型蛋白酶(P5147)、BSA(A1933)、Taurine(T0625-100G)、G-Lutamic acid(G8415)NaH2PO4、KOH Sigma公司NaCl、KCl、Glucose、KH2PO4、MgCl2國產分析純HEPES、EGTA BIOSHARP。

1.3主要實驗儀器恒溫水浴槽：JKI-MP-501A；超純水：MILLI-Q；倒置鏡：LeicaDMI3000B；Langendorff：自制灌流裝置。

1.4溶液配方無鈣臺式液:HEPES 15 mmol/L、MgCl21 mmol/L、NaCl 135 mmol/L、KCl 4 mmol/L、NaH2PO41 mmol/L、Glucose 10 mmol/L(NaOH調整溶液pH值為7.4)，KB液： L-Glutamic acid 50.3 mmol/L、KCl 39.97 mmol/L、KH2PO425 mmol/L、Taurine 19.98 mmol/L、MgCl23 mmol/L、KOH 80 mmol/L、EGTA 0.53 mmol/L、HEPES 10.7 mmol/L、Glucose 10.09 mmol/L(KOH調整溶液pH值為7.4)，酶液:0.16%蛋白酶、0.1%膠原酶、0.5 mg/ml胎牛血清(BSA，溶于無鈣臺氏液)

1.5實驗步驟

1.5.1實驗準備利用恒溫水浴槽、蛇形玻璃罐、60 ml注射器、普通輸液管道及調控開關搭建Langendorff灌流裝置，如圖1。75%乙醇溶液灌洗裝置3~5次，再使用去離子水灌洗3~5次。所有灌流液氧飽和15 min。

圖1　灌流裝置示意圖

1.5.2細胞分離斷頭處死大鼠，剪刀沿胸骨左右兩側剪開，用止血鉗夾住劍突，胸廓前翻，充分暴露胸腔，剪斷上下腔靜脈，自主動脈根部5 mm處剪斷主動脈。迅速將心臟置入4℃無鈣臺氏液中，修剪心臟，適當除去周圍組織，清洗血液，迅速將心臟懸掛至Langendorff灌流裝置上，3號絲線結扎固定，進行主動脈逆灌流，修建剩余的心臟周圍組織。先灌流無鈣臺式液3~5 min沖洗心臟剩余血液，無鈣臺式液剩余5 ml時加入5 ml酶液預灌流，待灌流液剩余5 ml繼續加入酶液，舍棄前10 ml的酶液，剩余酶液循環灌流12~15 min，酶解完成時心臟外觀主體呈現黃色和淡紅色，略微顯白，膨大30%~50%。取下心臟，在恒溫37℃含0.5 mg/ml BSA的KB液中剪取左心室，使用兩個鑷子拉碎心臟組織，吹打數次后300 r/min離心3 min，靜止3~5 min，去上清液，加入含0.5 mg/ml BSA的KB溶液里溫育30~40 min。等待復鈣。

1.5.3梯度復鈣分0.25、 0.5和1.0 mmol/L 3個梯度復鈣。去上清液，加入無鈣臺氏液溶液和50 μl 0.1 mol/L CaCl2溶液，細胞懸液總體積在20 ml，靜置10 min。重去上清液10 ml，加入10 ml 無鈣臺式液和75 μl 0.1 mol/L CaCl2溶液，靜置10 min。重去上清液10 ml，加入10 ml無鈣臺式液和150 μl CaCl2溶液。最終溶液中鈣離子濃度為1.0 mmol/L，將細胞懸液保存在4℃冰箱中或將細胞保存在4℃KB液中待用。

2結果

首次分離下的細胞在鏡下觀察，80%~85%的細胞呈長桿狀，細胞膜完整，橫紋清晰，透光度高，部分細胞核可見，與周圍邊界清晰且90%以上處于靜止狀態，少部分處于收縮狀或已收縮成團狀(圖2)。復鈣后，40%~50%的細胞維持桿狀，90%以上的桿狀細胞處于靜止狀態，胞膜完整邊緣清楚，表面光滑，立體感強，橫紋清晰，透光度好(圖3)。

圖2　首次分離心肌細胞(×100)

圖3　梯度復鈣后的心肌細胞(×100)

3討論

Langendorff裝置分離心肌細胞的方法技術已經很成熟，采用酶解法獲取成年大鼠的心肌細胞分離已長達40多年的時間，但迄今為止，尚未建立統一的方法，這是因為成年大鼠心肌細胞的急性分離方法受到了諸多因素的影響，如懸掛心臟速度、酶的選擇、酶濃度和酶解時間、復鈣濃度與方法、水pH、灌流液pH、環境溫度、灌流液溫度和大鼠狀態等〔1〕。

筆者認為其難點之一在于對心臟酶解完成時間的判斷，消化時間過長，酶會破壞細胞的細胞膜，造成不可逆的損傷；消化未完全，細胞產量將會降低，且靠強烈的吹打分離細胞對細胞膜也有一定的破壞性。有文章通過恒流灌流心臟來觀察灌流壓變化的方法來確定心臟的消化終點〔2〕,但不同的酶與大鼠之間的個體差異會使得心臟的消化終止壓不能完全統一，且操作較為復雜。鈣反?，F象是此實驗的另一大難點，高比例的存活心肌細胞在無鈣的環境下被分離出來，但是細胞再次進入生理濃度的鈣溶液時，會誘發內質網釋放大量的Ca2+，使胞質內鈣離子濃度迅速升高，抑制了心肌細胞舒張過程中必需的鈣離子和肌鈣蛋白的解離，細胞表現為不停地收縮，逐漸變圓，失去原有結構，最終呈團狀〔3，4〕。雖然在經過復鈣后心肌細胞存活比例會減小部分，但最終得到的心肌細胞的質量會顯著提高。

針對以上的問題，本實驗從以下幾個方面展開討論：①熟練性：從大鼠開胸到將心臟懸掛上Langendorff裝置的整個過程需要操作者有較高的熟練性，整個過程最好在2 min內完成。②灌流裝置的搭建：本文搭建的灌流裝置主要依靠重力勢差作為灌流動力，制作較為簡便且經濟，通過控制普通輸液器的開關或保持灌流管內液面的高度，可以控制灌流液的流速。整個裝置的高度在80~100 cm，可以放置在超凈臺中完成，使分離下的細胞處于無菌環境，因此分離的心肌細胞適用于原代培養。③灌流液的選擇：選用無鈣臺氏液灌流時，保證了細胞的無鈣環境，同時對橋粒和閏盤的分離也起一定的作用〔5〕。本實驗選用Sigma公司的Ⅱ型膠原酶，濃度為0.1%，聯合使用Sigma公司0.16%的蛋白酶和0.5 mg/ml的BSA配置成酶液30 ml循環灌流，酶液中的BSA具有細胞保護修復作用〔4〕，適宜的BSA在增加心肌細胞對酶耐受性的同時也能保護蛋白水解酶對膠原酶的水解，因此在酶液中加入BSA可以保護心肌細胞，也能夠保障酶的活性。④消化終點的判斷：本實驗通過觀察心臟顏色與心臟大小來判斷心臟消化終點，根據實驗中的觀察，灌流酶液前心臟呈紅色，質地較軟。灌流酶液后心臟開始膨脹，質地變硬，紅色逐漸退去，黃色漸漸明顯，在消化終點時心臟膨大30%~50%，心臟主體呈現黃色和淡紅色，略微顯白，此時應立即終止酶的消化。⑤復鈣：據報道心肌細胞的活性狀態是直接導致“鈣反?！钡母驹?，而實驗的每一步都可能影響到心肌細胞的狀態。⑥消化組織在KB液中完全拉碎后，應使用光滑圓頭的滴管小心吹打，注意不可混入空氣產生泡沫，且吹打次數不可過多，6~8次即可。另外，KB液溫度保持37℃，且加入0.5 mg/ml BSA可以提升細胞的鈣耐受性。試驗中發現，在消化組織吹打離心后，將分離細胞溫育在含0.5 mg/ml BSA的KB液中30~40 min有利于修復細胞膜，保持細胞膜的完整，但不可時間過長，使得BSA粘覆在細胞膜表面，影響其后的電生理學實驗〔6〕。未復鈣細胞在用于電生理研究時細胞直接接觸含鈣電極外液，復鈣過程太快導致大部分的細胞死亡，而四步法復鈣時間較長〔7〕。本實驗發現通過三步法“0.25、 0.5 、1.0 mmol/L 3個梯度復鈣”后細胞狀態較好，能夠減輕“鈣反?！保岣叽婊罴毎壤?/p>

4參考文獻

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2王云英,張然,余志斌.低壓恒流灌流分離成年大鼠心肌細胞〔J〕.中國應用生理學雜志,2005;21(4):475-8.

3熊壽貴,余更生.成年大鼠心肌細胞的急性分離方法探討〔J〕.重慶醫科大學學報,2008;33(7):864-7.

4Farmer BB,Mancina M,Williams ES,etal.Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts:review of the literature and description of a method〔J〕.Life Sci,1983;33(1):1-18.

5姚泰,吳博威.生理學〔M〕.第 6 版.北京:人民衛生出版社,2005:34-9.

6李慈珍,劉遠謀,王紅衛,等.耐鈣心肌細胞的分離和電生理特性觀察〔J〕.中國應用生理學雜,1994;10(4):359-62.

7趙臨,汪玲芳,尹永強,等.適合膜片鉗實驗的心肌細胞分離方法研究〔J〕.天津醫科大學學報,2010;16(1)：12-4.

〔2015-09-26修回〕

(編輯袁左鳴)

〔中圖分類號〕R332

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1578-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.018

通訊作者：趙海軍(1977-)，男，副教授，主要從事毒理學研究。

基金項目：浙江省教育廳項目(Y201226128，201330225，JA15815)

1廈門醫學高等?？茖W校

第一作者：施光正(1996-)，男，在讀本科生，主要從事心肌細胞電生理學研究。