褪黑素對糖尿病大鼠視網膜中糖基化終產物及其受體表達的影響

楊笑天　張建華　楊笑宇　王柏欣　王顯鋼　孟德欣　李　晶

(佳木斯大學附屬第一醫院眼科，黑龍江　佳木斯　154002)

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褪黑素對糖尿病大鼠視網膜中糖基化終產物及其受體表達的影響

楊笑天張建華1楊笑宇2王柏欣1王顯鋼1孟德欣1李晶1

(佳木斯大學附屬第一醫院眼科，黑龍江佳木斯154002)

〔摘要〕目的研究褪黑素(MT)對糖尿病大鼠視網膜中糖基化終產物(AGE)和其受體(RAGE)表達的影響。方法清潔級雄性Wistar大鼠80只，體重180~200 g，隨機分為正常對照組、模型對照組、低劑量MT組和高劑量MT組。模型對照組、低劑量MT組和高劑量MT組給予高脂高糖飲食配合鏈尿佐菌素腹腔注射誘導糖尿病模型。造模成功后，低劑量(10 mg·kg(-1)體重·d(-1))和高劑量(20 mg·kg(-1)體重·d(-1))MT灌胃16 w。HE染色觀察大鼠視網膜病理學改變，免疫組化(SABC)法檢測各組大鼠視網膜中AGE和RAGE表達的變化。結果16 w后，HE染色觀察，低劑量和高劑量MT組視網膜病理改變程度均較模型對照組輕。與模型對照組比較，免疫組化法檢測低劑量和高劑量MT組AGE和RAGE蛋白陽性表達量明顯降低(P<0.05)。結論MT可改善糖尿病大鼠視網膜形態變化，并可下調AGE和RAGE在糖尿病大鼠視網膜中的表達。

〔關鍵詞〕糖尿病視網膜病變；褪黑素；糖基化終產物；糖基化終產物受體

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病主要的并發癥之一，隨病情的進展，患者出現不可逆的視力下降，甚至失明。DR的發病機制復雜，糖基化終產物(AGE)及其受體(RAGE)在DR發生發展中起著重要的作用〔1~3〕。褪黑素(MT)是松果體分泌的一種重要激素，具有調節睡眠、生殖及晝夜節律等生理功能。研究發現，MT具有很強的抗氧化活性，并作為高選擇性電子供體，參與體內多種生化反應〔4〕。本實驗觀察MT對糖尿病大鼠視網膜中AGE和RAGE表達的影響及保護機制。

1材料與方法

1.1材料清潔級雄性Wistar大鼠80只，體重180~200 g(長春億斯實驗動物技術有限責任公司)；鏈尿佐菌素(STZ，美國Sigma公司)；MT，浙江黃巖延年褪黑素有限公司；RAGE單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；AGE多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒和濃縮型二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)

1.2模型的建立和分組大鼠適應性喂養1w后，隨機分為正常對照組、模型對照組、低劑量MT組和高劑量MT組，每組20只。模型對照組、低劑量MT組和高劑量MT在給予高脂高糖飲食4 w后，禁食24 h，按50 mg·kg-1·體重·d-1腹腔注射STZ，正常對照組注射等體積檸檬酸緩沖液。給藥后72 h，以空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。造模后，每天10∶00至14∶00灌胃一次，低劑量MT組灌胃劑量為10 mg·kg-1體重·d-1，高劑量MT組灌胃劑量為20 mg·kg-1體重·d-1，正常對照組和模型對照組用等體積生理鹽水灌胃，持續16 w。

1.3HE染色和免疫組化染色實驗結束時，無菌手術取出完整眼球置入4%多聚甲醛溶液中固定，常規石蠟包埋，4 μm連續矢狀切片。HE染色觀察視網膜病理改變。超敏二步法檢測AGE(一抗1∶100，4℃過夜)和RAGE(一抗1∶50，4℃過夜)表達改變。應用Image-ProPlus 6.0圖像分析系統計算AGE和RAGE的陽性染色平均灰度值。

1.4統計學處理應用SPSS16.0統計軟件進行方差分析。

2結果

2.1各組視網膜HE染色正常對照組視網膜HE染色切片可見，視網膜各層結構清晰，排列整齊。模型對照組視網膜各層排列紊亂，節細胞缺失，神經纖維層變薄，顆粒細胞排列紊亂，網狀結構疏松。低劑量MT組和高劑量MT組視網膜各層結構較清晰，排列較整齊，節細胞缺失少見，顆粒細胞排列較規整。見圖1。

圖1　各組視網膜HE染色(×200)

2.2各組視網膜AGE、RAGE含量變化AGE陽性表達見于視網膜各層內，棕黃色陽性表達物質無特殊表達部位。RAGE陽性表達主要見于節細胞層和神經纖維層，棕黃色陽性表達物質多見于細胞膜。與正常對照組比較，模型對照組、低劑量MT組和高劑量MT組AGE、RAGE表達含量顯著升高(P<0.05)；與模型對照組比較，低劑量MT組和高劑量AGE、RAGE陽性表達明顯降低(P<0.05)。見表1，圖2和圖3。

表1　各組視網膜中AGE和RAGE陽性

與正常對照組比較：1)P<0.05；與模型對照組比較：2)P<0.05

圖2　各組視網膜AGE免疫組化染色(×400)

圖3　各組視網膜RAGE免疫組化染色(×400)

3討論

DR病理表現為視網膜毛細血管周細胞功能障礙，甚至凋亡，毛細血管基底膜增生、微血管閉塞和無灌注微區出現，動脈瘤生成、眼底出血和滲出，增殖期表現為黃斑水腫和新生血管形成，纖維血管增殖及收縮牽拉，導致視網膜脫離〔5〕。正常人體的各種組織中有少量AGE形成，且其形成水平隨年齡增長可緩慢增加；對于糖尿病患者，在高血糖狀態下AGE的形成可被加速。氧化應激參與AGE的形成，且形成的AGE可使超氧自由基轉變成為活性更高的羥自由基，從而使機體內的氧化應激進一步增強。RAGE是AGE介導其病理損傷反應的信號轉導受體。AGE-RAGE相互作用可激活多個信號轉導途徑，引起氧化應激及相關細胞因子的合成，導致氧化損傷和炎癥反應，從而促進DR發展〔6，7〕。MT因其具有極強的抗氧化性，可直接清除細胞內氧自由基，可抑制氧化應激反應，從而可能進一步影響AGE的形成及其與RAGE的聯合作用。本實驗證實MT對糖尿病大鼠非酶糖基化過程具有抑制作用。

4參考文獻

1Fried LF，Emanuele N，Zhang JH，etal.Combined angiotensin inhibition for the treatment of diabetic nephropathy〔J〕.N Engl J Med，2013;369(20)：1892-903.

2陳百華，姜德詠，唐羅生.糖基化終產物對牛視網膜毛細血管周細胞內抗氧化能力的影響〔J〕.中華眼底病雜志，2002;18(2)：143-5.

3Curtis TM，Hamilton R，Yong PH，etal.Müller glial dysfunction during diabetic retinopathy in rats is linked to accumulation of advanced glycation end-products and advanced lipoxidation end-products〔J〕.Diabetologia，2011;54(3)：690-8.

4Tan DX，Chen LD，Poeggeler B，etal.Melatonin:a potent，endogenous hydroxyl radical scavenger〔J〕.Endocrinol J，1993;1(1)：57-60.

5Chen M，Curtis TM，Stitt AW.Advanced glycation end products and diabetic retinopathy〔J〕.Curr Med Chem，2013;20(26)：3234-40.

6Yamagishi S，Amano S，Inagaki Y，etal.Advanced glycation end products-induced apoptosis and over expression of vascular endothelial growth factor in bovine retinal pericytes〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2002;290(3)：973-8.

7Caldwell RB，Bartoli M，Behzadian MA，etal.Vascular endothelial growth factor and diabetic retinopathy:pathophysiological mechanisms and treatment perspectives〔J〕.Diabetes Metab Res Rev，2003;19(6)：442-55.

〔2014-12-19修回〕

(編輯杜娟)

〔中圖分類號〕R589.1

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1580-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.019

通訊作者：孟德欣(1973-)，男，醫學博士，副教授，主要從事糖尿病及其并發癥的發病機制研究。

基金項目：黑龍江省自然科學基金(D201046)；佳木斯大學人才培養項目(RC2010-018)

1佳木斯大學基礎醫學院2佳木斯大學附屬第二醫院

第一作者：楊笑天(1973-)，女，醫學碩士，副主任醫師，主要從事糖尿病眼病的研究。