參益安神片改善小鼠學習記憶的作用及其機制

宋　媛　蔡廣知　姜麗嬌　張雪萍　張宇翔　王莎莎　龐宇涵　貢濟宇

(長春中醫(yī)藥大學，吉林　長春　130117)

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參益安神片改善小鼠學習記憶的作用及其機制

宋媛蔡廣知姜麗嬌張雪萍張宇翔王莎莎龐宇涵貢濟宇

(長春中醫(yī)藥大學，吉林長春130117)

〔摘要〕目的探討復方制劑參益安神片改善記憶作用的藥效學及其作用機制。方法采用水迷宮試驗、避暗實驗、跳臺實驗觀察空白對照組、陽性對照組、復方制劑參益安神片高(1.607 g/kg)、中(0.536 g/kg)、低(0.269 g/kg)劑量組對小鼠改善記憶的作用；采用熒光法對小鼠腦內(nèi)5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)進行含量測定，初步研究復方制劑參益安神片改善小鼠記憶的作用機制。結(jié)果避暗試驗中劑量組、高劑量組小鼠的潛伏期明顯延長(P<0.05)，錯誤次數(shù)、進入暗室的動物數(shù)也明顯減少(P<0.05)；水迷宮試驗高劑量、中劑量組小鼠2 min內(nèi)到終點的動物明顯增加(P<0.05)；跳臺試驗潛伏期有明顯延長作用(P<0.05)；腦5-HT、DA、NE含量與空白組比較顯著增加。結(jié)論復方制劑參益安神片具有明顯改善記憶的功能,其機制可能與5-HT、DA、NE的相互調(diào)節(jié)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕參益安神片；學習記憶；5-羥色胺；多巴胺；去甲腎上腺素

參益安神片是在參芪五味子片〔1〕的基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻報道〔2，3〕按照中醫(yī)理論設(shè)計而成的處方，由人參、五味子、酸棗仁、益智四種中藥材組成。人參和益智仁為益智安神的常用藥，酸棗仁具有養(yǎng)心安神、斂汗的功效，它不僅是治療失眠不寐之藥，還能滋補強壯，久服能養(yǎng)心健腦；加用五味子，有酸斂收澀、益氣生津等功效，善治心腎兩經(jīng)的虛虧或不調(diào)引起的心神不安、驚悸失眠等。但復方制劑是否具有明顯的改善記憶、鎮(zhèn)靜催眠的作用未見報道。本文主要對復方制劑參益安神片改善記憶作用進行藥效學研究，并探討其作用機制。

1材料與方法

1.1實驗藥品及試劑復方制劑參益安神片，自制。含生藥量2 g/片(所需藥材均購于長春市宏檢大藥房)；棗東安神顆粒(北京優(yōu)你特藥業(yè)有限公司)批號：130501；實驗所需藥物均以蒸餾水配制所需濃度。酸性正丁醇、正庚烷、鄰苯二甲醛-鹽酸溶液、碘試液、半胱氨酸溶液、pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)、乙二胺四乙酸(EDTA)試液。

1.2動物健康昆明鼠種(KM)，18～22 g，雌雄各半，購于吉太小動物用品經(jīng)銷處：受試小鼠引進后置于長春中醫(yī)藥大學動物實驗室飼養(yǎng)。溫度：(20±3)℃,相對濕度：50%～70%。

1.3實驗儀器AL 204萬分之一天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；CaryEclipse分子熒光光度計(鄭州中譜儀器設(shè)備有限公司)R205恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)；T18 basic組織勻漿儀(廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司)；KQ3200DB數(shù)控超聲清洗器(廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司)；YLS3T型跳臺儀(廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司);BA-200小鼠避暗儀(廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司);Morris水迷宮實驗系統(tǒng)(北京中科院生理所)。

1.4方法將50只小鼠隨機分為空白對照組、陽性對照組、高劑量組(1.606 5 g/kg)、中劑量組(0.535 5 g/kg)、低劑量組(0.267 8 g/kg)，3個劑量組分別灌胃給藥參益安神片，空白對照組給予等量生理鹽水，陽性對照組給予棗東安神顆粒，灌胃15 d后，開始對各組小鼠進行訓練并測定。

1.4.1跳臺試驗〔4〕分別將小鼠放在絕緣平臺上(計時開始)。記錄第2次跳下平臺的潛伏期、3 min內(nèi)的跳下平臺的錯誤次數(shù)和各組跳下平臺的動物數(shù)。訓練3 d后開始測試。

1.4.2避暗實驗將小鼠置于電擊室，背對洞口，先給予條件刺激(燈光)15 s，在亮燈10 s后開始通電5 s(電擊強度為40 V、50 Hz)。記錄每只小鼠進入暗室的潛伏期、5 min內(nèi)進入暗室錯誤的次數(shù)和各組進入暗室的動物數(shù)。并計算5 min內(nèi)進入暗室(錯誤反應)的百分率，訓練5 d后開始測試。

1.4.3水迷宮實驗從訓練第1天開始，每批實驗各有1只小鼠給藥,平行操作,5 min后再給第二批小鼠注射,以此類推。每天訓練4次,每次隨機選擇一個入水點,觀察并記錄小鼠尋找并爬上平臺的路線圖及所需時間(潛伏期)。4次訓練小鼠分別從4個不同的入水點入水，如果小鼠在120 s內(nèi)未找到平臺，需將其引至平臺。這時潛伏期計為120 s，每次訓練間隔60 s，以4次的平均時間及路程作為每天的訓練成績，連續(xù)訓練5 d后開始測定。

1.4.4復方制劑參益安神片片對小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)的影響〔5，6〕

1.4.4.1腦組織NE含量測定上述實驗小鼠50只，斷頭取腦，將腦組織用冰生理鹽水清洗后吸干水分，天平稱取小鼠大腦重量，將小鼠大腦沿腦中線切開，取左半腦組織加入2 ml酸性正丁醇后勻漿，2 500 r/min離心5 min，分別取上清液0.4 ml,加正庚烷0.8 ml，加0.1 mol/L的HCl 0.2 ml超聲1 min，2 500 r/min離心5 min分別取底層水相。水相50 μl,加PBS 150 μl加EDTA 40 μl,加新配制的碘液20 μl，混勻，靜置3 min，分別加堿性磷酸鈉40 μl，混勻，靜置3 min，分別加醋酸40 μl，混勻，80℃水浴10 min，冷卻即得。吸取各樣品200 μl置96孔板內(nèi)，進行含量測定，激發(fā)波長382/488。

1.4.4.2腦組織中DA的含量測定上述實驗小鼠50只，斷頭取腦，將腦組織用冰生理鹽水清洗后吸干水分，天平稱取小鼠大腦重量，將小鼠大腦沿腦中線切開，去左半腦組織加入2 ml酸性正丁醇后勻漿，分別取上清液0.4 ml,加正庚烷0.8 ml，加0.1 mol/L的HCl 0.2 ml超聲1 min，2 500 r/min離心5 min分別取底層水相。水相50 μl,加PBS 150 μl加EDTA 40 μl,加新配制的碘液20 μl，混勻，靜置3 min，分別加堿性磷酸鈉40 μl，混勻，靜置3 min，分別加5 mol/L醋酸40 μl，混勻，100℃水浴15 min，冷卻即得。精密吸取各樣品200 μl置96孔板內(nèi)，進行含量測定，激發(fā)波長為325/385。記錄結(jié)果。

1.4.4.3腦組織中5-HT的含量測定上述實驗小鼠50只，斷頭取腦，將腦組織用冰生理鹽水清洗后吸干水分，天平稱取小鼠大腦重量，將小鼠大腦沿腦中線切開，去左半腦組織加入2 ml酸性正丁醇后勻漿，分別取上清液0.4 ml,加正庚烷0.8 ml，加0.1 mol/L的HCl 0.2 ml超聲1 min，2 500 r/min離心5 min分別取底層水相。取水相0.4 ml，加入0.25%半胱氨酸(新配)0.1 ml，再加入0.002%OPT-10 NHCl 3 ml。混勻，沸水浴10 min，冷卻即得。精密吸取各樣品200 μl置96孔板內(nèi)，進行含量測定，激發(fā)波長為368/480。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2結(jié)果

2.1復方制劑參益安神片跳臺實驗結(jié)果陽性對照組、中劑量組潛伏期與錯誤次數(shù)與空白對照組比較顯著差異(P<0.05或P<0.01)，高劑量組潛伏期與錯誤次數(shù)與空白對照組比較有極顯著性差異(P<0.01)。見表1。

表1　復方制劑參益安神片對小鼠跳臺實驗及避暗實驗的影響±s,n=10)

與空白對照組比較：1)P<0.05；2)P<0.01；下表同

2.2復方制劑參益安神片避暗實驗結(jié)果中劑量組錯誤次數(shù)與空白對照組比較有顯著差異(P<0.05)，高劑量組、陽性對照組錯誤次數(shù)與空白對照組比較有極顯著性差異(P<0.01)，其他4組測試潛伏期與空白對照組比較均有增長。見表1。

2.3復方制劑參益安神片水迷宮實驗結(jié)果中劑量組、高劑量組實驗完成時間〔(69.84±23.37)s、(65.45±22.98)s〕與空白對照組〔(114.82±7.96)s〕比較差異顯著(P<0.05)。陽性對照組為(101.72±26.32)s，低劑量組為(80.50±27.65)s。

2.4小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)測定結(jié)果見表2。高、中劑量

表2　復方制劑對小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)

組腦內(nèi)5-HT、DA、NE含量與空白對照組比較顯著增加(P<0.05)，低劑量組與空白對照組比較均升高，但無顯著差異(P>0.05)。

3討論

參益安神片選取了四味常用的中藥進行配伍，通過避暗試驗、跳臺試驗、水迷宮試驗可以看出無論是錯誤次數(shù)還是潛伏期給藥組都有所改善，其藥效與陽性對照藥對比藥效相當，因而從藥效學角度看來，參益安神片的改善學習記憶作用可以得到較充分的肯定，有較好的益智作用。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括兒茶胺和吲哚胺兩類，前者包括DA、NE和腎上腺素，后者為5-HT，大腦皮質(zhì)、紋狀體中存在大量的DA和5-HT能神經(jīng)末梢，他們對高級活動如感情、學習、記憶起重要作用。DA含量下降是腦功能衰老的表現(xiàn)之一，學習記憶增強常伴有NE、DA的增加，但對5-HT的報道還不是特別明確。參益安神片片改善小鼠學習記憶能力可能與5-HT、DA、NE的相互調(diào)節(jié)有關(guān)。相關(guān)文獻報道〔7〕，神經(jīng)中樞內(nèi)的DA代謝會影響NE的代謝,NE可能調(diào)節(jié)廣泛腦區(qū)的突觸傳入活動，增大環(huán)境中有意義的信息傳入，而抑制其他傳入刺激的干擾，從而提高注意力，增強學習能力。

本實驗采用熒光法對神經(jīng)遞質(zhì)的含量進行測定用于研究改善記憶的作用機制，熒光法與液相色譜法進行比較，熒光法實驗能提高實驗效率，目前試劑盒的應用也越來越廣泛,可以在后續(xù)的機制研究試驗中進行優(yōu)選。

4參考文獻

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3蔣益萍,張巧艷,張宏,等.正交試驗優(yōu)選五味子木脂素類成分的提取工藝〔J〕.中成藥,2013;35(11):2390-4.

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7杜暉.運動對去甲腎上腺素的影響及去甲腎上腺素在記憶中的作用〔J〕.科技信息(學術(shù)研究),2007;(36):243-5.

〔2015-07-26修回〕

(編輯袁左鳴)

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1587-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.022

通訊作者：貢濟宇(1960-)，女，碩士生導師，教授，主要從事藥物分析學研究。

基金項目：吉林省醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金計劃(No.20130727020YY)

第一作者：宋媛(1989-)，女，碩士，主要從事中藥分析學研究。