沙利度胺對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠MMP-9、COX-2、IL-6水平的影響

黃　鶴　倫偉健　梁曉燕　劉　瀏　賈柳萍

(佛山市南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東　佛山　528200)

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沙利度胺對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠MMP-9、COX-2、IL-6水平的影響

黃鶴倫偉健梁曉燕劉瀏賈柳萍

(佛山市南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東佛山528200)

〔摘要〕目的探討沙利度胺治療潰瘍性結(jié)腸炎(UC)大鼠的療效及對基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、環(huán)氧合酶(COX)-2、白介素(IL)-6水平的影響。方法利用隨機(jī)數(shù)字表法將60只雄性Wistar大鼠分為空白對照組、模型組、柳氮磺胺吡啶組和沙利度胺組，除空白對照組外，其余大鼠均應(yīng)用2,4,6-三硝基苯磺酸與乙醇溶液混合液復(fù)制UC模型，空白對照組和模型組給予生理鹽水灌胃；柳氮磺胺吡啶組給予柳氮磺胺吡啶混懸液灌胃；沙利度胺組給予沙利度胺片混懸液灌胃，于第3、7、10、14天觀察結(jié)腸炎癥活動指數(shù)評分(DAI)以及免疫組化結(jié)果。結(jié)果藥物干預(yù)不同時間點(diǎn)，四組大鼠DAI評分、MMP-9、COX-2和IL-6水平的總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組、柳氮磺胺吡啶和沙利度胺組DAI評分、MMP-9、COX-2和IL-6水平均高于空白對照組(P<0.05)。模型組DAI評分、MMP-9、COX-2和IL-6水平較柳氮磺胺吡啶和沙利度胺組高，柳氮磺胺吡啶組MMP-9、COX-2和IL-6水平較沙利度胺組高(P<0.05)。結(jié)論沙利度胺治療UC大鼠能夠顯著降低其DAI水平和MMP-9、COX-2、IL-6的表達(dá)，且其治療效果優(yōu)于柳氮磺胺吡啶，有待進(jìn)一步研究和推廣。

〔關(guān)鍵詞〕潰瘍性結(jié)腸炎；沙利度胺；基質(zhì)金屬蛋白酶9；環(huán)氧合酶-2；白介素-6

相關(guān)研究表明〔1〕，潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的病理改變與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)有關(guān)，而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在ECM的降解、組織的損傷和修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，MMPs裂解ECM成分通過改變內(nèi)皮細(xì)胞的通透性參與黏膜損傷和修復(fù)。此外，多種細(xì)胞因子如環(huán)氧合酶(COX)-2、白介素(IL)-6等也參與UC的進(jìn)展〔2〕。目前，UC的治療主要是針對發(fā)病機(jī)制的治療，包括阻斷炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能等。相關(guān)研究表明〔3〕，沙利度胺具有免疫調(diào)節(jié)、抗感染、抗血管生成作用。本研究旨在探討沙利度胺治療UC大鼠的療效及對MMP-9、COX-2、IL-6水平的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物健康清潔級雄性Wistar大鼠(山東魯抗醫(yī)藥公司實(shí)驗(yàn)動物中心，質(zhì)量合格證：SCXK(魯)2013 0001)60只，體重220~260 g。普通飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度18℃~20℃，相對濕度50%~60%，光照12 h/d。

1.2藥品和實(shí)驗(yàn)試劑柳氮磺胺吡啶腸溶片(上海中西三維藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H31020450)；沙利度胺片(常州制藥廠有限公司，國藥準(zhǔn)字H32026130)。2,4,6-三硝基苯磺酸(美國Sigma公司)；牛血清蛋白(美國Sigma公司)；鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(武漢博士德生物工程有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒(德國Roche公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動物分組利用隨機(jī)數(shù)字表法將60只雄性Wistar大鼠分為空白對照組、模型組、柳氮磺胺吡啶組和沙利度胺組，每組15只。空白對照組大鼠給予0.9%Nacl溶液灌腸，造模后放回鼠籠，蘇醒后繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)。其余大鼠禁食不禁水48 h，經(jīng)腹腔注入水合氯醛(10%，0.3 mg/100 g)，深度麻醉后將新生兒吸痰管(直徑6F)石蠟潤滑后，從肛門向內(nèi)插入8 cm，將2,4,6-三硝基苯磺酸(100 mg/kg)與乙醇溶液(50%，0.3 ml)混合液由肛門注入，將大鼠尾部提起，倒置2~3 min，防止藥物流出。

1.3.2藥物干預(yù)空白對照組和模型組給予生理鹽水10 ml·kg-1·d-1灌胃；柳氮磺胺吡啶組給予柳氮磺胺吡啶混懸液100 ml·kg-1·d-1灌胃；沙利度胺組給予沙利度胺片混懸液200 ml·kg-1·d-1灌胃。1次/d，連續(xù)2 w。

1.3.3取材及標(biāo)本處理給藥2 w后，處死大鼠，固定，經(jīng)心臟取血，采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(ELISA)測定MMP-9、COX-2和IL-6的水平。沿腹中線切開腹壁，分離結(jié)腸，截取距肛門2~10 cm部分結(jié)腸組織，沿腸系膜剪開腸腔，用4℃生理鹽水沖洗。

1.4觀察指標(biāo)分別于藥物干預(yù)第3、7、10、14天時進(jìn)行結(jié)腸炎癥活動指數(shù)評分(DAI)，依據(jù)DAI評分標(biāo)準(zhǔn)〔4〕，對大鼠體重下降百分比、大便性狀和血便情況進(jìn)行統(tǒng)計，取均值作為最終得分，并檢測免疫組化結(jié)果(包括MMP-9、COX-2和IL-6水平)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件行方差分析、LSD法。

2結(jié)果

2.1各組大鼠DAI評分比較藥物干預(yù)不同時間點(diǎn)，四組大鼠DAI評分的總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。藥物干預(yù)第3、7、10、14天模型組、柳氮磺胺吡啶和沙利度胺組大鼠DAI評分均高于空白對照組(P<0.05)。藥物干預(yù)第7、10、14天模型組大鼠DAI評分較柳氮磺胺吡啶和沙利度胺組高，且第14天時，沙利度胺組DAI評分顯著低于柳氮磺胺吡啶組(P<0.05)。見表1。

表1　不同組別大鼠DAI評分比較，分，n=15)

與對照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；與柳氮磺胺吡啶組比較：3)P<0.05；下表同

2.2各組大鼠免疫組化結(jié)果比較四組大鼠MMP-9、COX-2和IL-6水平的總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組、柳氮磺胺吡啶和沙利度胺組MMP-9、COX-2和IL-6水平均高于空白對照組(P<0.05)。模型組MMP-9、COX-2和IL-6水平較柳氮磺胺吡啶和沙利度胺組高，柳氮磺胺吡啶組各指標(biāo)水平較沙利度胺組高(P<0.05)。見表2。

表2　各組大鼠免疫組化結(jié)果比較

3討論

近年來，UC的發(fā)病率也逐漸升高，一般認(rèn)為是由遺傳、環(huán)境和免疫等多種因素改變所致的過于活躍的黏膜免疫應(yīng)答引起，主要侵及直腸、結(jié)腸黏膜層和黏膜下層，以ECM的降解和潰瘍形成為主要特點(diǎn)〔5〕。腸道通透性是反映腸道屏障能力的重要指標(biāo)，通透性的改變可能是UC反復(fù)發(fā)作的重要因素之一。MMPs裂解ECM成分可改變腸黏膜通透性，因此在腸炎癥的發(fā)生中起重要作用，MMP-9通過降解基底膜中的Ⅳ型膠原，阻止炎癥的擴(kuò)散〔6〕。薛永舉等〔7〕在炎癥性腸病研究中均發(fā)現(xiàn)MMP-9和UC的活動呈正相關(guān)，能夠降低黏膜的防御功能從而誘發(fā)結(jié)腸炎癥。此外，COX-2、IL-6等多種細(xì)胞因子也參與了UC的發(fā)展。COX-2基因位于第1號染色體，正常生理情況下機(jī)體組織中分布極少，在外界刺激下，產(chǎn)生大量COX-2，促進(jìn)組織合成致炎性前列腺素，尤其是前列腺素E2，介導(dǎo)發(fā)熱、疼痛等炎癥病理生理過程〔8〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)〔9〕，UC患者結(jié)腸組織炎性細(xì)胞中COX-2表達(dá)顯著升高,提示COX-2在UC病理生理過程中發(fā)揮重要作用。IL-6又稱前炎癥細(xì)胞因子，主要由T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，可通過體液免疫、細(xì)胞免疫等途徑影響宿主防御功能和組織損傷，具有急性期反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答功能，在抗感染免疫反應(yīng)中起重要作用〔10〕。IL-6的升高與疾病的活動期、腫瘤的發(fā)展變化等密切相關(guān)，是UC發(fā)展過程中的重要炎性遞質(zhì)。

目前，UC的治療主要是通過阻斷炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能的發(fā)病機(jī)制的治療，依據(jù)疾病嚴(yán)重程度、病變部位等制定個體化治療方案，控制炎癥，緩解癥狀，防止并發(fā)癥。常用治療藥物包括氨基水楊酸制劑(如5-氨基水楊酸、柳氮磺胺吡啶等)、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑以及其他輔助治療藥物等〔11〕。沙利度胺最早被用于治療早孕反應(yīng)，但因證實(shí)與海豹樣畸形兒有關(guān)致其撤市。近年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)該藥具有免疫調(diào)節(jié)、抗感染、抗血管生成作用，并用于腫瘤治療〔12〕。

本研究結(jié)果可能是造模后，大鼠處于急性病變期，出現(xiàn)運(yùn)動減少、進(jìn)食量減少、體重下降、稀便伴有血便等癥狀。本研究提示沙利度胺療效更好。研究還說明沙利度胺下調(diào)相關(guān)指標(biāo)表達(dá)作用更好，沙利度胺能夠調(diào)節(jié)UC大鼠免疫功能。

綜上所述，沙利度胺治療UC大鼠能夠顯著降低其DAI水平和MMP-9、COX-2、IL-6的表達(dá)，且其治療效果優(yōu)于柳氮磺胺吡啶，但其安全性有待進(jìn)一步探討。

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〔2015-07-11修回〕

(編輯袁左鳴)

〔中圖分類號〕R57

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1594-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.025

第一作者：黃鶴(1971-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事HP根除的現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)方面的研究。