通絡救腦注射液對大鼠腦缺血/再灌注神經保護作用的研究

康　康　冀書娟　梅海云

河南信陽市中心醫院神經內科　信陽　464000

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通絡救腦注射液對大鼠腦缺血/再灌注神經保護作用的研究

康康冀書娟梅海云

河南信陽市中心醫院神經內科信陽464000

【摘要】目的觀察通絡救腦注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用機制。方法參照Longa法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。實驗大鼠隨機分為假手術組、模型組、通絡救腦組。于腦缺血/再灌注24 h進行行為學評分，HE染色法檢測腦組織病理變化，并且檢測大鼠腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)活性的變化，Western blot檢測NF-κB的表達結果。結果與模型組相比，通絡救腦注射液能明顯改善大鼠神經行為，減輕腦組織病理改變，降低MDA含量，明顯升高SOD、GSH活性，下調NF-κB表達。結論通絡救腦對大鼠腦缺血再灌注損傷神經有保護作用，其作用機制可能為抑制氧化損傷和炎癥。

【關鍵詞】通絡救腦；腦缺血再灌注；HE染色；蛋白質印跡；神經保護

通絡救腦注射液具有清熱解毒活血作用，適用于治療缺血性腦病，其處方組成為梔子苷和三七總皂苷[1]。現代藥理學研究表明，通絡救腦具有改善學習記憶[1-3]、保護血管[4]、促進神經細胞突觸可塑性[5]等廣泛藥理作用，并能透過血腦屏障，故臨床上可用于防治神經障礙、缺血性腦病及老年性癡呆。腦缺血/再灌注時通常會引起神經細胞損傷，究其原因與氧自由基過度釋放、炎癥反應等緊密相關[6]。當自由基的產生遠超機體自身的清除能力時，會造成自由基蓄積，損害血管內皮、破壞細胞膜及細胞器中的不飽和脂肪酸，進而損傷神經組織。此外中樞神經系統的過度炎癥反應除了影響局部血流供應，還會直接破壞組織結構，而腫瘤壞死因子及白介素-6等炎性介質的釋放會進一步加重血腦屏障的破壞，從而使缺血損傷放大，加重神經功能損傷。本文采用經典的線栓法制備腦缺血/再灌注損傷大鼠模型，研究通絡救腦對病理大鼠的保護作用，并初步探討其作用機制。

1材料

1.1實驗動物 PF級Wistar大鼠，雌雄各半，體質量282～326 g，實驗動物購自北京大學醫學部動物實驗中心(動物許可證號：SCXK(京)2006-0008)。

1.2藥物與試劑絡救腦注射液(天津紅日藥業有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，谷胱甘肽(GSH)試劑盒由碧云天生物技術研究所提供。

1.3儀器溫超速離心機，電子天平。

2方法

2.1實驗分組與給藥成年健康雄性Wistar大鼠60只，按體質量隨機分為3組，每組20只。假手術組：腹腔注射生理鹽水；腦缺血/再灌注模型組：腹腔注射生理鹽水；通絡救腦注射液組：預處理14 d，腹腔注射通絡救腦(50 mg/kg)。實驗大鼠手術前1 d禁食禁水。

2.2腦缺血再灌注模型制備 采用Longa法[7]制備局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(劑量300 mg/kg)，麻醉后仰臥位固定，于頸正中切口，分離皮下組織、肌肉，繼續分離頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈，結扎頸外動脈后在頸總動脈作一切口，插入線栓，向顱內方向推進約18 mm，此時大鼠中動脈被阻塞并導致腦缺血。結扎入口處，縫合，2 h后拔出線栓進行再灌注。

2.3大鼠行為障礙評分 按Longa評分法，分別于術后24、72 h對實驗大鼠進行神經功能評分，標準如下：0分癥狀最輕，未見明顯異常；1分為腦缺血/再灌注部位對側前爪不能完全伸直；2分為實驗大鼠向腦損傷部位對側轉圈，屬中度灶性神經缺陷；3分為大鼠向腦損傷對側傾倒，屬嚴重局灶性神經缺陷；不能自發行走，意識昏迷者記4分[7]。

2.4生化指標評測待行為學評分試驗結束后，每組取8只大鼠，斷頭、取腦，腦組織加適量生理鹽水制成1%的勻漿液，3 500 r/min離心10 min后，取上清液，測定蛋白濃度，總蛋白含量采用BCA蛋白試劑盒測定；SOD、GSH和MDA含量按照各自說明書進行。

2.5組織病理學分析各實驗組分別隨機選取6只大鼠，斷頭處死后取腦，福爾馬林固定，7 d后脫水、包埋、切片及HE染色。光鏡下觀察腦組織的結構變化[8]。

2.6NF-κB檢測取腦組織，加4倍裂解液(v/w)制成勻漿，Western blot檢測含量。

2.7統計學處理 統計學分析采用SPSS 13.0軟件，計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗，計數資料以率(%)表示，采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

3結果

3.1對腦缺血/再灌注大鼠神經癥狀的影響 腦缺血/再灌注模型組大鼠出現行走時步態不穩且向左側傾斜、提尾懸空左前肢內收等明顯的神經癥狀。術后48、72 h評分中，由表1可知，通絡救腦組與模型組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。通絡救腦注射液能不同程度地改善腦缺血/再灌注損傷大鼠的行為障礙，對腦缺血模型大鼠的神經功能具有一定的保護作用。

表1　腦缺血再灌注大鼠神經功能評分　±s，n=12)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組比較，△△P<0.01

3.2生化評價結果由圖2可知，模型組大鼠SOD、GSH活性均比假手術組大鼠明顯降低，MDA含量卻升高。通絡救腦組能明顯提高SOD、GSH活性，降低MDA含量，說明藥物可以在一定程度上降低腦缺血/再灌注模型大鼠的氧化損傷。

表2　通絡救腦注射液對腦缺血/再灌注損傷大鼠血清中

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3.3HE染色結果在光鏡下觀察可見假手術組大鼠腦組織結構正常，胞質豐富，神經細胞外形規則、排列整齊，核仁清晰可見。模型組缺血側神經細胞變性，周圍間隙增寬，部分結構不清，胞體縮小。與模型組相比，通絡救腦能明顯減輕上述病理改變，神經細胞結構改變減輕，結果見圖1。

圖1　HE染色結果(×400)　A假手術組　B模型組　C通絡救腦組

3.4Western blot檢測結果結果發現模型組大鼠NF-κB的表達(0.964±0.23)高于假手術組(0.716±0.15)，差異具有統計學意義(P<0.01)；而通絡救腦組大鼠NF-κB的表達(0.864±0.18)低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

圖2　通絡救腦對腦缺血再灌注大鼠NF-κB 表達的影響

4討論

腦組織對缺氧高度敏感，腦缺血再灌注時，缺血區神經細胞壞死，造成蛋白水解酶及活性氧(ROS)等物質釋放，從而引發局部炎癥反應[8]。此外，氧化應激會造成缺血后的神經元損傷，加速脂質過氧化，從而改變腦內的抗氧化體系。MDA是氧自由基發生脂質過氧化反應后的代謝物，反映機體的脂質過氧化程度，其含量高低能說明機體受自由基攻擊的嚴重程度；SOD、GSH則為自由基清除劑，能夠清除自由基，對機體具有保護作用，其活性越高，說明機體清除自由基能力越強。研究發現，大鼠在腦缺血/再灌注后，神經功能會出現不同程度損傷，甚至有腦梗死出現，而通絡救腦注射液能降低神經功能障礙的發生率、改善大鼠皮層神經元核固縮、減輕運動障礙；此外，通絡救腦注射液能提高SOD、GSH活性，降低MDA含量。本實驗觀察到通絡救腦注射液通過抗氧化作用從而減少氧化損傷和神經元缺失，說明其具有神經保護作用。

有研究表明，腦缺血時NF-κB活化，加速細胞死亡、加速炎癥反應，采用降低其活性的措施則會縮小腦梗死體積[9]。本實驗中，模型組大鼠在腦缺血再灌注初期時，新皮質NF-κB活性已升高，并隨時間的延長快速升高，NF-κB的活化又進一步增大了腦梗死體積。采用通絡救腦注射液后，能降低NF-κB活性，從而對腦缺血再灌注起到保護作用。

5參考文獻

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[9]Zheng Z，Yenari MA.Post-ischemic inflammation:molecular mechanisms and the rapeutic implications[J].Neurol Res，2004，26(8):884-892.

(收稿2015-04-20)

【中圖分類號】R743

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)05-0057-03