肝臟腫瘤標本資源庫的建立、維護及管理

嚴錦，程思杰，余靈祥，洪智賢，吳建中，王瑞蘭，張克明，孫百軍，張培瑞，王兆海，楊鵬輝，張紹庚（中國人民解放軍第三〇二醫院　肝膽外科中心，北京　100039）

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肝臟腫瘤標本資源庫的建立、維護及管理

嚴錦，程思杰，余靈祥，洪智賢，吳建中，王瑞蘭，張克明，孫百軍，張培瑞，王兆海，楊鵬輝，張紹庚
（中國人民解放軍第三〇二醫院肝膽外科中心，北京100039）

[摘 要]目的探討建立以肝癌組織樣本為主的肝臟外科生物樣本庫及相關數據信息化管理的方法和標準化操作規程，為臨床與基礎研究提供高質量的臨床標本資源平臺。方法 收集肝臟腫瘤手術患者的血液標本（血清、血漿、白細胞）、組織標本(癌、癌旁、遠端正常組織)，將處理好的血液標本于-80 ℃冰箱保存，新鮮組織置液氮保存，定期隨機抽取液氮保存的腫瘤組織樣本進行RNA、DNA的提取及鑒定。結果現收集并保存有完整臨床信息及隨訪資料的肝臟腫瘤患者血液標本22 103份，組織標本3 319例，其中肝臟腫瘤組織標本807例，包括肝臟惡性腫瘤762例，良性腫瘤23例，肝硬化組織22例。隨機抽取組織RNA、DNA鑒定均符合標本質量標準，能夠滿足后續實驗要求。結論 初步建立標準化、規范化的肝臟腫瘤標本庫，制定了標準化的標本庫維護和管理規程，為肝臟腫瘤基礎和臨床研究提供了寶貴的實驗材料。

[關鍵詞]肝臟腫瘤；生物樣本庫

Establishment,maintenance and management of liver tumor biobank YAN Jin,CHENG Si-jie,YU Ling-xiang,

HONG Zhi-xian,WU Jian-zhong,WANG Rui-lan,ZHANG Ke-ming,SUN Bai-jun,ZHANG Pei-rui,WANG Zhao-hai,YANG Peng-hui,Zhang Shao-geng.Center of Hepatobiliary Surgery,302 Military Hospital,Beijing 100039,China

Abstract objectiveTo study the measures and standard operation procedure for establishing the biobank of liver surgical samples and information management of related data about samples,providing a high quality clinical specimen resource platform for clinical and basic research.MethodsBlood samples from patients with liver tumor(serum,plasma,leukocyte)and tissue samples(cancer tissues,tissues adjacent to carcinoma and the distal normal tissues)were collected,and then be kept in -80 ℃ refrigerator or in liquid nitrogen for preservation.Samples were randomly selected for the extraction and identification of RNA and DNA.ResultsA total of 22 103 blood samples with complete clinical information and follow-up data of liver tumor patients were collected and saved,807 cases of tissue specimens,of which there were 762 cases of malignant liver tumor,23 cases of benign tumors,22 cases of liver cirrhosis.Random tissue specimens of RNA and DNA identifications were preserved in high quality standards and could meet the requirements of the following studies.Conclusion A standardized and normalized liver tumor specimen biobank is established and the standard specimen library maintenance and management procedures are formulated,which provides valuable experimental materials for basic and clinical research for liver tumor.

Key words liver tumor; biobank

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，簡稱肝癌）是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發病率第3位，死亡率第2位[1]。近年來肝癌在世界范圍內發病率仍呈現上升趨勢，尤其在東南亞國家肝癌的高患病率和高病死率（總體病死率0.95），已成為當前社會主要的健康威脅之一[2]。肝癌長期預后欠理想，根治性切除術后，其5年累積復發率仍高達70%，而且復發肝癌比原發腫瘤的侵襲性更高[3-4]?？偠灾?，肝癌相關研究仍缺乏關鍵性進展，HCC現在仍嚴重威脅著人類的健康和生命。

不同于大多數其他類型的癌癥，肝癌有著獨特且復雜的腫瘤發生、發展機制，這種復雜性對肝臟腫瘤標本庫科學合理的分類和建立提出了極大挑戰。一方面，肝癌的主要發病因素除了原發性外，研究者更傾向于關注包括乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、肝硬化、脂肪肝及代謝疾病等誘導的肝癌發生機制[5-6]。從世界范圍看，肝炎的分布區域與肝癌的高發區域基本重合，肝臟的慢性炎癥也被認為是肝癌發生和發展的主要危險因素。另一方面，肝臟是許多異質性惡性腫瘤（如惡性消化道腫瘤、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤、神經內分泌瘤等）轉移、定植的最易受累區域之一，約35%的結腸癌患者在其病程發展過程中已形成肝轉移癌[7-10]?？梢哉f，肝癌臨床上復雜的特性對于其標本庫的建立提出更為苛刻的要求。建立、管理及維護肝臟腫瘤標本庫，規范、合格、準確地保存肝癌組織樣本，完整臨床數據對于肝癌發生的相關發病機制和遺傳易感性等基礎醫學研究具有決定性作用，對于臨床上早期發現、精確分期，對患者提供個體化治療顯得尤為關鍵[11]。

本中心依托肝病?？漆t院、解放軍傳染病研究所的臨床資源優勢，成功建立肝臟腫瘤生物樣本庫及其信息管理系統，其職責是系統采集、保存和開發利用以肝癌患者為主的手術切除組織和血液標本，對其進行維護管理，為臨床與基礎研究提供合格的臨床標本資源平臺。

1 材料和方法

1.1標本來源

全部肝臟腫瘤樣本源來自2013年10月至2015年9月就診于本中心的患者，納入標準：（1）診斷為原發性肝癌、肝臟良性腫瘤及原發性肝癌肝內轉移的患者；（2）患者樣本采集均符合醫學倫理學標準。排除標準：（1）其他腫瘤轉移到肝臟上的患者；（2）術前接受過介入或射頻熱毀損治療者；（3）HIV及梅毒陽性者予以排除。

1.2儀器設備

三洋-80 ℃冰箱（MDF-53V），海爾DW-86L626超低溫冰箱并配套金屬凍存管盒架，-20～4 ℃冰箱（海爾BCD-215KS），微量加樣器（Eppendorf），生物安全柜（Thermo1300 SERIES A2），液氮罐，離心機等。

1.3標本收集

1.3.1血清和血漿的采集、處理及保存：符合納入標準進行手術治療的患者均采集血液標本?；颊咝g

前、術中、術后當天至出院前等不同時間段取血，每次采抗凝及不抗凝3 mL各一管，不抗凝血室溫靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min，用微量加樣器小心吸取血清，按每管200 μL分裝成4份，作蛋白組學的分析；另1份3 mL EDTA抗凝，采血后輕輕顛倒混勻3次靜置，防止溶血?？鼓? h內分離血漿，1 500 r/ min離心20 min，用微量加樣器小心吸取血漿，按每管200 μL分裝成4份。然后用吸管在界面白膜處吸取白細胞留取2份于凍存管中保存。血漿、血清、白細胞在采血后2 h內凍存在-80 ℃冰箱中。

1.3.2組織標本的采集、處理及保存：（1）新鮮組織的采集及保存：符合納入標準進行手術治療的患者在不影響病理診斷取材的前體下收集組織標本。由專人在標本離體后30 min內，取腫瘤組織（盡量沖盡血液）、癌旁組織（癌組織旁1～3 cm以內）、正常組織（癌組織旁5 cm以外或最遠處）。用相機拍攝記錄標本取材部位，將標本切成小塊（0.5 cm×0.5 cm，厚度＜0.5 cm），標記后迅速放入液氮保存。

1.3.3標本的標記和儲存：上述標本分裝入凍存管，在電腦虛擬標本庫中相同位置登記入庫，打印出小瓶標簽。標簽分為兩部分，一為圓形的單獨二維碼，一為長方形標簽，標簽內容分為兩行：一行為患者ID號，一行為小瓶標志符。標識符包括入庫日期、疾病類型、樣本ID、性別、樣本類型、樣本管數。將標簽貼于標本瓶身，圓形二維碼貼于瓶蓋面。例如，標本小瓶標志符140612C22HBA0001812FBP1代表的是2014年6月12日入庫，乙肝肝癌，樣本ID號0001812，女性，血漿1號。

1.3.4生物樣本數據庫的信息化管理：采用美國RURO公司FreezerPro冷凍樣品智能信息系統。（1）樣本源信息錄入：①標準區域：患者住院號（ID號）、姓名；②用戶自定義區域：性別、年齡、隨訪聯系方式、病理號、有無其他疾病（肝性腦病、冠心病、高血壓、糖尿病、腎病）、病史（病毒感染史、治療史、吸煙史、飲酒史、其他重要疾病史等）。（2）樣本信息錄入：①標準區域：患者住院號（ID號）、姓名、容量、樣品源、樣品組、樣品所有者；②用戶自定義區域：采集日期、入庫日期、疾病類型編碼、采集時間段、術后/日、復查術后/月、離心后樣品狀態、負責醫生、采集人員、收集人員、處理人員），臨床信息（血常規檢測、肝功檢測、凝血功能檢測、腫瘤標志物、肝炎指標、肝癌早期預警、甲戊肝三項、自身抗體五項、淋巴細胞亞群測定、自身免疫性肝病、肝纖維四項、其他檢查）。（3）標本使用管理：①標本出庫清單：申請編號、申請人、出庫日期、出庫人、標本類型、名稱編號、精確位置、出庫狀況、出庫數量、用戶簽收；②標本使用反饋表：日期、申請編號、項目名稱、使用人姓名、聯系電話、單位、標本質量、標本要求、標本類型、標本數量、使用人簽名。

1.3.5標本的質量檢測：每2周定期隨機抽取組織及血液標本，按照試劑盒說明書操作，抽提RNA、DNA，并對其完整性進行檢測。

2 結果

2.1標本收集情況

截至2015年9月共收集標本25 422份，其中組織標本3 319份，外周血標本22 103份。肝臟腫瘤組織標本807例，其中肝臟惡性腫瘤762例，良性腫瘤23例，相關肝硬化22例。術前、術中、術后共收集血清9 240份，血漿9 178份；血液白細胞3 685份。所收集對象年齡為7～80歲，平均47.4歲；男性522例，約占64.7%；女性285例，約占35.3%。

2.2標本DNA提取及鑒定

從現有的組織樣本庫中隨機抽取保存期為1年的液氮樣本1例（癌和癌旁），依據TAKARA公司DNA提取試劑盒說明書提取樣本組織DNA，提取后經1%瓊脂糖凝膠150 V電壓下電泳15 min，紫外燈下顯示所檢測的DNA完整性良好，可滿足后續實驗要求（圖1）。

圖1　隨機抽取組織樣本DNA電泳圖

2.3標本RNA提取和鑒定

從現有的組織樣本庫中隨機抽取保存期為1年的液氮樣本5例（癌和癌旁），經Ambion mirVana miRNA Isolation Kit提取并純化凍存組織RNA，經紫外分光光度計分析A260/A280≥1.8，對總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，發現標本的完整性較好，抽取樣本RNA均可見清晰的28 S及18 S條帶，結果表明，組織樣本保存1年后，提示樣本RNA質量完好，可滿足后續實驗研究（圖2）。

3 討論

全球每年肝癌新發超過50萬，中國占50%以上，每年死于肝癌的人數達到11萬，且其發病率和死亡率有逐年上升趨勢。肝癌早期診斷率只有30%，確診時多數患者已進入中晚期，患者發病五年后生存率僅為2%～10%，平均生存期4～6個月[1]。隨著對肝臟腫瘤研究的深入，相關研究機構對肝臟腫瘤標本的需求日益增長。既往研究機構、研究人員僅限于針對某一課題的需要，進行有目的的腫瘤標本的收集，造成了臨床標本資源的極大浪費，給深入研究腫瘤的生物學特征造成了很多不便，為此，建立腫瘤標本庫成為現代腫瘤學研究的迫切任務。中國區肝癌的特點：90%以上合并病毒性肝炎（HBV陽性），85%合并肝硬化，丙肝肝癌發病率呈上升趨勢[12]，肝癌在其發生、發展過程中影響因素錯綜復雜。解放軍302醫院作為全軍最大的傳染病肝病?？漆t院，技術力量雄厚，肝臟腫瘤標本來源充足。本樣本庫由專人負責，技術嫻熟，經過兩年時間的努力，目前我們生物樣本庫庫存腫瘤組織3 319份，外周血標本22 103份。同時，定期每3個月對組織標本、血液（血清、血漿和白細胞）標本進行檢測，發現標本保存質量良好，安全符合后續實驗要求。此外，我們應用美國RURO公司FreezerPro冷凍樣品智能信息系統用于肝癌組織庫的管理，每例手術患者均有相對應的完整的儲存于數據庫中的病歷資料和隨訪記錄及精確位置。

肝臟腫瘤尤其是肝癌的研究是目前肝病領域的研究熱點及難點，大多數均為個別研究，而系統深入的研究則需建立一個標準的標本資源庫，這樣既能保證研究的同質性、又能最大程度地利用有限的肝癌標本資源。腫瘤組織樣本質量控制體系的規范化建立是標本庫的關鍵，更是為科研實驗提供的合格實驗材料[13]。本中心標本庫經過兩年的運作及經驗總結，質量控制體系應著重注意以下幾點：（1）標本的收集及使用管理：標本收集工作由經過培訓的專人負責，嚴格依據標本收集規范進行，組織離體時間不超過20 min，取材后應迅速放置于液氮中保存，盡可能避免標本內DNA、RNA及蛋白的降解，標本采集部位應嚴格按照要求進行[14]；標本出庫使用后，應及時對相關實驗結果進行反饋總結。（2）標本庫的日常維護：制定嚴格的標本庫管理的規章制度及相關操作規范，加強相關人員的培訓及管理；定期檢測標本庫的液氮保存裝置及低溫冰箱，保證溫控設備及監控報警設備完好，避免應設備故障發生標本反復凍融[15]。及時跟蹤患者隨訪復查，收集術后標本及相關臨床資料，建立和完善臨床數據庫。（3）標本庫隨機抽樣檢測：定期隨機抽取組織樣本，檢測樣本中DNA、RNA的完整性，明確樣本是否發生降解，保證標本庫中保存的組織樣本符合生物樣本保存質量標準要求，同時滿足后續科研實驗需要[16]。

綜上所述，本中心具備成功建立和合理使用肝臟腫瘤樣本庫的軟硬件條件，有能力建成高質量的肝臟腫瘤生物標本庫。此外，在現有基礎上，本中心還將繼續從以下方面擴大、豐富肝臟腫瘤生物樣本庫：收集家族性共患肝臟腫瘤患者標本便于研究遺傳因素在腫瘤發生發展中的作用；收集罕見肝臟腫瘤病例，便于深入研究罕見肝臟腫瘤發病機制，以求探索新的臨床診斷和治療策略。

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（本文編輯：魯翠濤）

·論著 基礎研究·

[通訊作者簡介]張紹庚，主任醫師，博士，E-mail：Zhangsg302@hotmail.com。

作者簡介][第一嚴錦（1975-），女，陜西漢中人，主管技師。

[收稿日期]2015-09-15

[中圖分類號]R735.7

[文獻標識碼]A

doi:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.02.007