一種小鼠胰島經(jīng)門靜脈肝內(nèi)移植方法及療效評價

蔣煊，傅紅興，邱凱燕，何云強，徐艷艷，祝青卉（.溫州醫(yī)科大學　藥學院，浙江　溫州　35035；.麗水市中心醫(yī)院　藥劑科，浙江　麗水　33000）

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一種小鼠胰島經(jīng)門靜脈肝內(nèi)移植方法及療效評價

蔣煊1，傅紅興1，邱凱燕1，何云強1，徐艷艷2，祝青卉1
（1.溫州醫(yī)科大學藥學院，浙江溫州325035；2.麗水市中心醫(yī)院藥劑科，浙江麗水313000）

[摘 要]目的 介紹一種糖尿病小鼠經(jīng)門靜脈到肝內(nèi)胰島移植的方法并進行移植前后的血糖、口服糖耐量、免疫組化等評價。方法 采用Balb/c小鼠，將分離純化的小鼠胰島培養(yǎng)6 h后，用自制的移植工具進行糖尿病模型小鼠的肝門靜脈插管和輸注胰島，移植胰島量為（320±30）IEQ，對移植前后的小鼠血糖進行測定，在移植后第10天進行糖耐量試驗，并取受體小鼠肝臟，進行HE染色和免疫組化分析，觀察胰島細胞團在肝內(nèi)的存活情況。結(jié)果 受體小鼠胰島移植后血糖均能長期維持正常，糖耐量試驗結(jié)果顯示與正常小鼠無統(tǒng)計學差異（P=0.81），組織學結(jié)果顯示胰島細胞在小鼠肝內(nèi)存活良好。結(jié)論 采用本方法可建立小鼠胰島經(jīng)門靜脈移植到肝內(nèi)的模型，為下一步進行胰島移植相關藥物篩選及免疫學等方面研究奠定了基礎。

[關鍵詞]胰島移植；門靜脈；療效；Balb/c小鼠

大學生創(chuàng)新訓練項目（201410343002）。

A method of islet allotransplantation through portal vein into mouse liver and the effect evaluation JIANG Xuan1,

FU Hong-xing1,QIU Kai-yan1,HE Yun-qiang1,XU Yan-yan2,ZHU Qing-hui1.1School of Pharmaceutical Sciences,Wenzhou Medical University,Wenzhou,Zhejiang 325035,China;2Department of Pharmacy,Lishui Central Hospital,Lishui,Zhejiang 313000,China

Abstract objectiveAn improved method about how to transplant islets through portal vein into liver in mouse were introduced,and blood glucose,glucose tolerance and histological stain after transplantation were evaluated.MethodsBalb/c mice were used in this experiment.The(320±30)IEQ purified isletswere cultured for 6 h before cannulated in portal vein and infused into the liver of mouse by a modified instrument for transplantation.Then the blood glucose was tested regularly,the oral glucose tolerance test was done at the 10thday and the liver was cut at the 10thday after the islet transplantation.The HE and immunofluorescence analysis of islet in the liver were also carried out to evaluate the islet morphology and function.ResultsMice recipient achieved and maintained normal blood glucose for a long time after islet transplantation.OGTT results at 10thday after islet transplantation showed that the blood glucose levels of mice had no significant difference with those of normal mice(P=0.81).And the results of immunohistochemical analysis showed that the activity of islets was good after transplantation.ConclusionThe method can establish a model of islets allotransplanted into the mouse liver of mouse via portal vein,which provides a good foundation for further research on drug screening and immunology.

Key words islet transplantation; portal vein; curative effect; Balb/c mouse

胰島經(jīng)肝門靜脈輸注使細胞定植于肝臟是臨床胰島移植常用的方法，并在相關疾病治療中顯示了良好的效果[1-3]。小鼠胰島經(jīng)肝門靜脈移植治療小鼠糖尿病的模型建立難度較大，該手術(shù)需要成熟的小鼠胰島分離技術(shù)、培養(yǎng)和活性鑒定技術(shù)、顯微外科操作和術(shù)后護理經(jīng)驗，小鼠門靜脈插管出血風險大，因此國內(nèi)外鮮有文獻報道。

本文在本實驗室多年的小鼠胰島分離和移植工作基礎上[4-5]，結(jié)合國內(nèi)外操作經(jīng)驗[6-7]，創(chuàng)立了一種新的小鼠胰島經(jīng)門靜脈移植治療小鼠糖尿病的操作方法，并對術(shù)后小鼠的血糖、糖耐量、肝內(nèi)胰島等進行了測定和染色，為后續(xù)進行胰島移植相關藥物篩選及免疫學等方面研究奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物：雄性Balb/c小鼠40只，SPF級，8～12周齡，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.1.2試劑和實驗器材：膠原酶V、二乙酸熒光素（FD）、碘化吡啶（PI）（Sigma公司，美國）；Histopaque-1119?、Histopaque-1077?（Sigma公司，美國）；CMRL1066（溫州市怡康細胞移植技術(shù)開發(fā)有限公司）；DKZ-450B電熱恒溫振蕩水槽（上海森信實驗儀器有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；離心機（L500，上海利鑫堅離心機有限公司）；NIKON YS100顯微鏡（南京江南永新光學有限公司）；體視顯微鏡（SDT-TL2，上海光泉光科儀器有限公司）；Hanks液。

1.2實驗方法

1.2.1糖尿病模型的建立：造模前小鼠禁食12～16 h，測定空腹血糖和稱重，腹腔注射STZ（55 mg/kg），72 h后測血糖≥13.88 mmol/L為糖尿病造模成功，模型穩(wěn)定1周后選取血糖20～30 mmol/L的小鼠行肝門靜脈胰島移植。

1.2.2胰島分離純化：參考前期實驗基礎[4-5]，簡述如下：Balb/c小鼠經(jīng)逆行膽總管灌注V型膠原酶溶液2 mL（濃度2.0 mg/mL，Hanks液配制），取下膨脹的胰腺放入含5 mL同濃度V型膠原酶的50 mL離心管中，在（37.0±0.5）℃恒溫水浴中振搖消化，消化后胰腺組織用Hanks洗滌和Histopaque?-1119、Histopaque?-1077純化，并結(jié)合體視顯微鏡下用手工挑選，得到高純度的小鼠胰島，用CMRL1066（含10%胎牛血清和青鏈霉素）在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后進行移植。

1.2.3胰島計數(shù)和當量計算：參考Lembert等[8]制定的方法并加以改進，將培養(yǎng)后的胰島細胞團在帶標尺的顯微鏡下進行計數(shù)和估算其直徑，換算至直徑相當于150 μmol胰島的當量。

1.2.4胰島活性測定[6]：取移植前胰島細胞團約25個，加入PI、FD各7 μL，稍混勻后避光在熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況，發(fā)紅色光為死亡細胞，發(fā)綠色光為活細胞，估算綠色細胞占整個胰島團的面積比例，取其平均值即為胰島活性。

1.2.5門靜脈胰島移植：參考文獻[6-7，9]并作適當改進，具體如下：（1）移植工具的制備：將一次性200 μL電泳點樣用吸頭剪去尖頭，剪取一段6號不銹鋼針針頭，稍彎折后接到剪去尖頭的點樣用吸頭上，剪去吸頭尾端直徑較大部分，使其能密封連接1 mL注射器針筒（如圖1所示）。（2）胰島準備：將（250±50）IEQ胰島混懸至培養(yǎng)液中，吸至1 mL移植工具中，待胰島沉淀后，棄去部分上清溶液，使溶劑量達約0.3 mL，翻轉(zhuǎn)注射器，使胰島慢慢沉降并混懸至吸頭的尖頭部。（3）移植手術(shù)操作：糖尿病小鼠術(shù)前15 min皮下注射50 μL頭孢唑啉鈉（濃度：50 g/L），持續(xù)吸入異氟烷麻醉后，固定小鼠，剃去腹部毛發(fā)，用酒精消毒手術(shù)野，用眼科剪沿腹白線剪開腹部皮膚，用拉鉤固定腹壁，在體視顯微鏡下用無菌棉簽撥開小腸和十二指腸，暴露膽總管和門靜脈。將胰島再次混懸，在體視顯微鏡下順血流方向?qū)⑨橆^插入門靜脈，緩慢推注胰島混懸液，使其隨血流緩慢進入肝臟，推注時間約10～20 s，液體量0.1～0.2 mL。推注完畢，用棉簽壓迫出血點約1～2 min（必要時采用止血海綿），觀察無出血后，關閉腹腔，并注射1 mL生理鹽水補液。

1.2.6術(shù)后護理及療效評價：

（1）血糖監(jiān)測：術(shù)后小鼠每12 h注射100 μL頭孢唑啉鈉抗炎，持續(xù)一周，并術(shù)后2天內(nèi)每12 h測定血糖，之后每日測定1次血糖，直至連續(xù)兩次血糖超過16.7 mmol/L后宣告移植物失效[10]。

（2）口服糖耐量試驗（OGTT）：胰島移植第10日取3只小鼠各測1次OGTT，參考文獻[10]，小鼠禁食過夜后，將葡萄糖溶于蒸餾水（濃度為300 mg/mL）后給其灌胃，劑量為2.0 mg/g，于灌胃后20、40、60、90、120 min測定血糖值，以正常鼠和糖尿病鼠相同測定方法作對照，對比各時間點血糖峰值，評價胰島功能和移植的效果。

（3）肝臟內(nèi)胰島的組織學評價：取胰島移植后第10天的小鼠，持續(xù)異氟烷吸入麻醉下剪開腹部皮膚和肌肉層，并破心處死，用顯微外科剪在肝臟固定位置切取肝臟組織，用4%多聚甲醛液固定24 h，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、HE和免疫組化染色，顯微鏡下觀察組織HE和胰島素免疫組化染色結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1純化后的小鼠胰島及活性

4只Balb/c小鼠一次可純化得到（789±253）個胰島；所得胰島為圓形或橢圓形的細胞團，邊界清晰，純度達（93.6±4.3）%。培養(yǎng)后的胰島經(jīng)FD-PI染色后，可見胰島大部分體積呈綠色，活性達到（92.8± 3.4）%。

2.2胰島經(jīng)門靜脈移植及血糖變化結(jié)果

小鼠胰島經(jīng)門靜脈移植的工具如下圖1所示，胰島細胞團沉積至近點樣吸頭細部時（如圖中箭頭所示），經(jīng)簡單混懸后插門靜脈輸注胰島。糖尿病小鼠胰島移植后的血糖變化如下圖2所示。

圖1　胰島移植的工具　　圖2　小鼠胰島移植前后的血糖變化（TG為移植組，CG為對照組）

由圖2結(jié)果可知，胰島移植后部分小鼠血糖在24 h內(nèi)降至正常，48 h內(nèi)部分小鼠的血糖值有波動。移植成功后的小鼠血糖控制穩(wěn)定，并可長時間維持血糖在正常水平（＞30 d）。

2.3移植后胰島的組織學檢查

取移植胰島后的小鼠肝臟，經(jīng)HE染色和胰島素免疫組化染色，結(jié)果如下圖3所示。

由圖3結(jié)果可知，移植后胰島緊貼在肝血管內(nèi)（圖3A和3B中黑色框中所示），胰島在肝臟中依然保持了較好的細胞團形狀，且胰島素分泌旺盛（圖3B中染色結(jié)果所示）。

圖3　肝臟內(nèi)移植的小鼠胰島HE和免疫組化染色結(jié)果（移植后第10天）

2.4糖耐量試驗結(jié)果

由圖4結(jié)果可見，胰島移植后小鼠在灌胃葡萄糖后血糖升高峰值明顯低于高血糖小鼠（P=0.001），而與正常小鼠的血糖值變化無差異（P=0.81），說明移植后的胰島功能良好，能控制血糖至正常值范圍。

圖4　小鼠的糖耐量試驗結(jié)果

3 討論

傳統(tǒng)小鼠胰島門靜脈內(nèi)移植往往采用注射器吸取胰島后通過普通針頭輸注至門靜脈內(nèi)[6]，但胰島細胞團容易在針管和針頭部位殘留，對移植的結(jié)果影響較大。本文介紹了一種自制的胰島移植工具，該工具有漏斗形胰島輸注頭，避免了注射針管和針頭周圍的死角，胰島輸注后殘留少，移植數(shù)量準確。

小鼠門靜脈壁薄且短，插管處極易出血，導致小鼠死亡，為避免門靜脈出血過多，本實驗組采用自制止血棉對進針口進行覆蓋和壓迫，止血效果大大改善，術(shù)后小鼠的存活率達到80%以上。但門靜脈內(nèi)胰島移植后小鼠在術(shù)后五日內(nèi)的死亡率依然高達40%，遠低于腎被膜下胰島移植（幾乎100%）[9]，解剖顯示死亡小鼠的肝臟表面和內(nèi)部有較多白點，可能與小鼠肝臟體積小，血管細，胰島細胞團栓塞至肝臟血管后導致局部缺血和肝損傷有關，胰島移植的液體量、輸注速度和移植前胰島分散均勻度都可能會影響移植效果[11]。本方法建立了一種小鼠胰島經(jīng)肝門靜脈到肝內(nèi)的移植模型，為下一步進行胰島移植相關藥物篩選及免疫學等方面研究奠定了基礎。

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（本文編輯：魯翠濤）

[通訊作者簡介]傅紅興，副教授，E-mail：hx_fu79@163.com。

作者簡介][第一蔣煊（1994-），男，浙江臺州人，本科。

[基金項目]浙江省自然科學基金項目（LQ12H30001）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺骨干人才計劃（2012RCB041）；國家級

[收稿日期]2015-08-20

[中圖分類號]R657.5

[文獻標識碼]A

doi:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.02.011